Mikroprzepływowa metoda oparta na chipie do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili przy użyciu krwi pełnej

Do próbki krwi pełnej dodać specyficzne kompleksy przeciwciał skierowane przeciwko komórkom krwi, z wyjątkiem neutrofili.

Dodaj cząsteczki magnetyczne, które wiążą się z komórkami krwi związanymi z kompleksem przeciwciała.

Przenieś immunomagnetycznie znakowaną próbkę do portu ładowania komórek chipa mikroprzepływowego.

Podłącz dyski magnetyczne do portu ładowania komórki.

Pole magnetyczne przyciąga immunomagnetycznie znakowane komórki, więziąc je na bocznych ścianach portu.

Neutrofile, nie będąc oznakowane, przepływają do chipa i zostają uwięzione w obszarze dokowania komórki.

Dodać znakowany fluorescencyjnie roztwór chemoatraktantu i pożywkę migracyjną do wyznaczonych zbiorników. Ciecze przepływają przez kanały mikroprzepływowe, tworząc gradient stężeń.

Kiedy chemoatraktant wiąże się z receptorem neutrofili, wyzwala zmiany wewnątrzkomórkowe, powodując reorganizację neutrofili i wydłużenie pseudopodów.

Te pseudopody działają jak stopy, popychając neutrofile w kierunku wyższych stężeń chemoatraktantu - proces zwany chemotaksją.

Stosować odpowiednie techniki mikroskopowe do monitorowania migracji neutrofili w odpowiedzi na gradient chemoatraktantu.

Usuń wodę dejonizowaną z urządzenia i dodaj 100 mikrolitrów roztworu fibronektyny z wylotu. Odczekaj trzy minuty, aby upewnić się, że wszystkie kanały są wypełnione roztworem fibronektyny. Następnie inkubuj urządzenie na przykrytej szalce Petriego przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń roztwór fibronektyny z urządzenia i dodaj 100 mikrolitrów pożywki migracyjnej z wylotu. Ponownie odczekaj trzy minuty, aby upewnić się, że wszystkie kanały są wypełnione nośnikiem migracji. Inkubuj urządzenie przez kolejną godzinę w temperaturze pokojowej, przed użyciem urządzenia w eksperymencie chemotaksji. Umieść 10 mikrolitrów pełnej krwi w 1,5-mililitrowej probówce. Następnie dodaj 2 mikrolitry koktajlu przeciwciał do dwóch mikrolitrów cząstek magnetycznych z zestawu do izolacji neutrofili i delikatnie wymieszaj probówkę w celu magnetycznego znakowania komórek oznaczonych przeciwciałami. Inkubować mieszaninę etykiet przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie przymocuj dwa małe dyski magnetyczne po obu stronach portu ładowania ogniw urządzenia. Zassać pożywkę ze wszystkich portów urządzenia. Następnie powoli odpipetuj dwa mikrolitry znakowanej mieszaniny krwi do urządzenia mikroprzepływowego z portu ładowania komórek. Umieść urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu z kontrolowaną temperaturą w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Poczekaj kilka minut, aż wystarczająca ilość neutrofili zostanie uwięziona w obszarze dokowania komórki.

Następnie dodać 100 mikrolitrów roztworu chemoatraktantu w pożywce migracyjnej o objętości 100 mikrolitrów do wyznaczonych zbiorników wlotowych za pomocą dwóch pipetorów. W ten sposób zostanie wygenerowany gradient chemoatraktantu poprzez ciągłe mieszanie chemiczne oparte na przepływie laminarnym. Chemoatraktantem mogą być białka rekombinowane, takie jak FMLP, lub próbki kliniczne, takie jak supernatant plwociny od pacjentów z POChP.

Po ustabilizowaniu przepływu uzyskaj obrazy fluorescencyjne gradientu dekstranu FITC w kanale. Następnie należy inkubować urządzenie na stoliku mikroskopowym z kontrolowaną temperaturą lub w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych przez 15 minut. Po inkubacji zobrazuj kanał gradientu, używając 10-krotnego obiektywu, aby zarejestrować końcowe pozycje komórki do analizy danych.