JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 5:04 min. • July 8th, 2025
Weźmy dwie populacje limfocytów T CD8 +: efektorowe limfocyty T CD8 + wstępnie aktywowane przez zaangażowanie limfocytów T i receptorów kostymulujących za pośrednictwem przeciwciał oraz stłumione limfocyty T CD8 + hamowane przez komórki supresorowe pochodzące z mieloidu.
Dodaj te limfocyty T do studzienek pokrytych błoną podstawną z komórkami rakowymi wyrażającymi białko fluorescencyjne o ograniczonym jądrze.
Pipetować fluorogenny substrat kaspazy-3 — barwnik fluorogenny wiążący DNA, sprzężony z peptydem zawierającym miejsce rozpoznawania kaspazy-3.
Inkubować. Receptory efektorowych limfocytów T wiążą się z kompleksem peptydowym MHC klasy I na komórkach nowotworowych, wywołując uwalnianie cytotoksycznych granulek zawierających perforyny i granzymy.
Perforyny tworzą pory błony komórkowej raka, umożliwiając wnikanie granzymu i aktywację kaspazy, inicjując apoptozę.
Aktywowane kaspazy dodatkowo rozszczepiają fluorogenny substrat kaspazy, uwalniając barwnik, który wiąże się z DNA i fluoryzuje.
Pod mikroskopem fluorescencyjnym komórki rakowe hodowane wspólnie z efektorowymi limfocytami T wykazują podwójną fluorescencję jądrową, co wskazuje na apoptozę komórek rakowych.
W przeciwieństwie do tego, komórki rakowe hodowane wspólnie z tłumionymi limfocytami T wykazują tylko fluorescencję białek jądrowych, co sugeruje komórki nieapoptotyczne.
Aby skonfigurować wstępnie aktywowaną kohodowlę komórek docelowych CD8-dodatnich limfocytów T, najpierw dodaj 30 mikrolitrów rozcieńczonej rozpuszczalnej macierzy błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu od 1 do 100 do odpowiednich dołków 96-dołkowej płytki o płaskim dnie, odpowiedniej do mikroskopii. Potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić matrycę, a następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na co najmniej godzinę. Podczas gdy płytka się równoważy, przygotuj komórki docelowe. Odessać pożywkę, przemyć PBS i dodać 1 mililitr 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
Dodać 9 mililitrów DMEM uzupełnionego płodową surowicą bydlęcą przez delikatne pipetowanie i przenieść zdysocjowane komórki do probówek. Po odwirowaniu komórek ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach EDMEM. Przefiltruj zawieszone komórki przez sitko i policz żywe komórki. Następnie dostosuj gęstość do 4 razy 10 do czwartej komórki docelowej na mililitr w świeżym EDMEM na lodzie.
Następnie kilkakrotnie odpipetuj wstępnie aktywowane limfocyty T CD8-dodatnie, aby ponownie zawiesić komórki w zawiesinie jednokomórkowej i przenieś pływające limfocyty T do jednej 1,5-mililitrowej probówki na warunek. Zbierz wszelkie pozostałe komórki z 200 mikrolitrami PBS na studzienkę, przenieś popłuczyny do odpowiednich 1,5-mililitrowych probówek i odwiruj. Odessać pożywkę i dodać 1 mililitr EDMEM do każdej probówki w celu odwirowania.
Po odwirowaniu ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach świeżego EDMEM na probówkę. Po zliczeniu dostosuj komórki w każdej probówce do gęstości 1,6 razy 10 do piątych wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8-dodatnich na mililitr pożywki i umieść komórki na lodzie. Gdy komórki są gotowe, odessać matrycę błony podstawnej z każdej studzienki 96-dołkowej płytki mikroskopowej i dodać 50 mikrolitrów komórek docelowych do poszczególnych dołków w wewnętrznych 60 dołkach płytki z mieszaniem.
Dodać 25 mikrolitrów EDMEM uzupełnionych 4 razy 10 do trzecich jednostek na mililitr IL-2 i 10 mikromolowych substratów kaspazy fluorogennej-3 do odpowiednich studzienek. Następnie dodaj 25 mikrolitrów wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8-dodatnich do odpowiednich studzienek, a na koniec dodaj EDMEM do odpowiednich studzienek, aby uzyskać całkowitą objętość do 100 mikrolitrów. Dodaj 200 mikrolitrów PBS lub sterylnej wody do wszystkich pustych studzienek, potrząśnij płytką i pozostaw płytkę na płaskiej powierzchni na 10 minut.
Aby zobrazować komórki, ustaw mikroskop tak, aby uzyskiwał obrazy w kontraście fazowym, a także kanały fluorescencyjne odpowiednie dla białka fluorescencyjnego o ograniczonym jądrze oraz fluorogenicznych fluoroforów substratu kaspazy-3 aktywowanego w eksperymencie. Następnie uchwyć obrazy każdej studzienki eksperymentalnej w kontraście fazowym i dwóch kanałach fluorescencyjnych co jedną do trzech godzin przez co najmniej 72 godziny.