Test mikroneutralizacji do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących w surowicy ludzkiej

Do testu mikroneutralizacji należy pobrać płytkę wielodołkową zawierającą inaktywowaną termicznie, seryjnie rozcieńczaną surowicę ludzką o malejących stężeniach przeciwciał neutralizujących specyficznych dla grypy.

Wprowadź chorobotwórcze wirusy grypy. Przeciwciała w surowicy oddziałują z wirusami i neutralizują je; Jednak wyższe rozcieńczenia surowicy wykazują ograniczoną neutralizację wirusa.

Nasienie z komórkami nerki psów Madine-Darby lub komórkami MDCK, powodującymi nadekspresję reszt ludzkiego kwasu sjalowego na swojej powierzchni.

W wyższym rozcieńczeniu niezneutralizowane wirusy grypy łączą się z kwasem sjalowym komórek, uwalniając genom wirusa do cytoplazmy komórki.

Geny wirusa są transkrybowane i tłumaczone na białka wirusowe i nukleoproteiny w komórce gospodarza.

Potraktuj wysokim stężeniem acetonu w celu utrwalenia i przepuszczalności.

Wprowadź przeciwciała pierwotne, które oddziałują z nukleoproteinami wirusa.

Nakładka z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z enzymami, które oddziałują z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Umyj i potraktuj substratem enzymu, wytwarzając produkt barwiący.

Określ ilościowo intensywność koloru i wykreśl je w stosunku do rozcieńczenia surowicy; najwyższe rozcieńczenie surowicy, osiągające pięćdziesięcioprocentową neutralizację wirusa, reprezentuje miano neutralizacji.

W 1. dniu testu MN rozmrozić surowice w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i usunąć natychmiast po rozmrożeniu. Dezaktywuj ludzkie surowice na gorąco przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 56 stopni Celsjusza, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie umieścić surowice na lodzie i dodać rozcieńczalnik wirusa do surowicy, aby uzyskać wstępne rozcieńczenie od 1 do 10.

Aby przeprowadzić test z jednym wirusem, dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczalnika wirusa do rzędów od B do H, z wyjątkiem kolumn 11 i 12. Następnie dodać 100 mikrolitrów 1 z 10 rozcieńczonych surowic do kolumn A1 do A10. Wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczanie od rzędów A do H i wyrzucić ostatnie 50 mikrolitrów w rzędzie H.

W celu kontroli wirusa dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczalnika wirusa do studzienek A12, B12, C12 i D12. W celu kontroli komórki dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczalnika wirusa do studzienek E12, F12, G12 i H12. Dla surowic kontrolnych dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonych surowic kontrolnych do basenika A, kolumna 11, i dodać 50 mikrolitrów rozcieńczalnika wirusa do baseników od B11 do H11. Przystąp do seryjnego rozcieńczania. Przykryj płytki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, aż będą gotowe do dodania wirusa.

W celu dodania wirusa należy rozcieńczyć wirusa do 100 TCID50 w 50 mikrolitrach z rozcieńczalnikiem do wirusa. Dodać 50 mikrolitrów rozcieńczonego wirusa do wszystkich studzienek, z wyjątkiem kolumny 11 na tylnych płytkach miareczkowania i studzienek kontrolnych E12, F12, G12 i H12 na wszystkich płytkach. Dodać 50 mikrolitrów rozcieńczalnika do wirusów do wszystkich studzienek w kolumnie 11. Następnie dodaj 50 mikrolitrów wirusa w 100 TCID50 w 50 mikrolitrach do pierwszego dołka.

Następnie wymieszaj i przenieś 50 mikrolitrów do kolejnych studzienek, aby wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia. Wymieniaj końcówki pipet między studzienkami, aby uniknąć przenoszenia wirusa. Wyrzucić 50 mikrolitrów z dołka H11, a następnie dodać 50 mikrolitrów rozcieńczalnika wirusa do kolumny 11, aby doprowadzić końcową objętość do 100 mikrolitrów. Stuknij w talerze, aby wymieszać. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez godzinę przed wykonaniem dodawania komórek MDCK w pierwszym dniu i ELISA w drugim dniu, tak jak poprzednio.

Po dodaniu przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przeprowadzić dodawanie substratu i odczyt płytki. Umyj płytki pięć razy 300 mikrolitrami buforu do mycia i postukaj w niestrzępiącą się chusteczkę. Dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego substratu OPD do każdej studzienki. Następnie inkubuj płytki w temperaturze pokojowej, aż studzienki kontrolne wirusa osiągną gęstość optyczną 490 nanometrów w zakresie od 0,8 do 3, przy czym kontrola komórki przy niskim poziomie tła OD mniejszym niż 0,2. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do wszystkich studzienek.

Odczytać średnicę zewnętrzną studzienek przy 490 nanometrach za pomocą spektrofotometru z mikropłytkami. Na koniec należy określić miano przeciwciał neutralizujących w każdej próbce surowicy, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.