JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 3:42 min. • July 8th, 2025
Pobrać mikropłytkę zawierającą jednolite segmenty pochewki wycięte z sadzonek ryżu i krążki liściowe uzyskane z liści rośliny ryżu.
Dodaj sterylną wodę i inkubuj przez noc, aby umożliwić regenerację po naprężeniu rany.
Dodaj immunogenny peptyd pochodzący z wici bakteryjnej, który działa jak wzór molekularny związany z patogenem lub PAMP.
Komórki roślinne na krawędziach cięcia wiążą się z PAMP za pośrednictwem receptorów rozpoznawania wzorców.
Wiązanie wyzwala sygnalizację w dół, aktywując enzym zlokalizowany w błonie plazmatycznej, zwany homologiem oksydazy wybuchowej układu oddechowego lub RBOH.
Aktywowany RBOH wytwarza reaktywne formy tlenu lub ROS w apoplastach - przestrzeni międzykomórkowej. Wytworzony ROS jest przekształcany w nadtlenek wodoru.
Dodaj enzym peroksydazę i podłoże chemiluminescencyjne.
Peroksydaza wykorzystuje nadtlenek wodoru do przekształcenia substratu w pośredni stan wzbudzony, który uwalnia energię w postaci światła i powraca do stanu podstawowego.
Zmierz luminescencję w obu typach tkanek, aby wykryć gwałtowny wzrost natychmiast po leczeniu PAMP, wskazujący na wybuch ROS.
Pochewkę z 10-dniowych sadzonek ryżu należy przeciąć na 3-milimetrowe segmenty za pomocą ostrej żyletki lub ostrza chirurgicznego w celu wstępnego leczenia na dzień przed testem ROS. Umieść 5 segmentów osłonki w pojedynczym dołku na 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania zawierającej 100 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody na 10 do 12 godzin.
Odetnij krążki liściowe z cztero- i sześciotygodniowych roślin ryżu za pomocą stempla biopsyjnego z tłokiem. Zawsze przycinaj talerze liści od środkowej jednej trzeciej drugiego liścia głównego glebogryzarki, aby zmniejszyć różnice w danych. Następnie umieść jeden krążek liścia w pojedynczym dołku na 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania zawierającej 100 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody na 10 do 12 godzin w celu wstępnej obróbki. Utrzymuj wszystkie krążki liściowe unoszące się na wodzie i skierowane do góry w dołkach płytki do mikromiareczkowania w celu wstępnego uzdatniania wody, aby uniknąć zmian związanych ze stroną liścia.
Przygotować roztwór elicytacyjny, łącząc 9,4 ml 50 mikromolowych tris-HCl, 400 mikrolitrów roztworu L-012, 100 mikrolitrów peroksydazy chrzanowej i 100 mikrolitrów flg22. Dodaj 200 mikrolitrów roztworu elicytacyjnego do studzienek.
Uruchom oprogramowanie i kliknij przycisk Eksperymenty, aby utworzyć nowy protokół lub użyć istniejącego protokołu. Kliknij opcję Procedura w oknie podręcznym, aby skonfigurować płytę i wybrać studzienki z płyty, które mają być monitorowane. Kliknij przycisk Start Kinetic i ustaw czas działania na 30 minut lub dłużej, w zależności od wymagań eksperymentalnych. Wybierz minimalny interwał, aby uzyskiwać odczyty tak często, jak to możliwe, a jako czas integracji wybierz 1 sekundę lub dłużej, w zależności od intensywności sygnału.
Kliknij Zatwierdź, a następnie OK, aby potwierdzić ustawienia. Następnie kliknij Wykryj nową płytę w wyskakującym okienku i poczekaj, aż oprogramowanie wyświetli monit o wyświetlenie okna dialogowego płyty obciążenia. Ostrożnie usunąć podwójnie destylowaną wodę ze studzienek zawierających wstępnie poddane obróbce tkanki, unikając uszkodzenia tkanek lub wysuszenia. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 200 mikrolitrów roztworu elicytacyjnego do studzienek zawierających tkanki. Umieść tabliczkę, która ma być testowana, na nośniku i rozpocznij wykrywanie.