Test resazuryny agarowej z węglem drzewnym w celu oceny aktywności badanego związku przeciwko prątkom

Weź płytkę wielodołkową zawierającą prątki. Dodać do studzienek zwiększające się stężenia badanych związków.

Inkubować. W zależności od działania związku na prątki, może on hamować wzrost prątków, wykazując działanie bakteriostatyczne, lub eliminować prątki, wykazując działanie bakteriobójcze.

Dobrze przenieść podwielokrotności do testu reazuryny z węglem drzewnym lub CARA, mikropłytki zawierającej agar z węglem aktywnym w celu wchłonięcia badanego związku, zapobiegając efektom przenoszenia.

Inkubować. Aktywność bakteriostatyczna związku hamuje replikację prątków, podczas gdy aktywność bakteriobójcza zmniejsza żywotność prątków.

Dodaj bufor, rezazurynę i niejonowy środek powierzchniowo czynny, aby zdyspergować rezazurynę w studzienkach.

W metabolicznie aktywnych prątkach dehydrogenazy redukują niebieską, słabo fluorescencyjną rezyzynę do różowej, fluorescencyjnej rezorufiny.

Za pomocą czytnika mikropłytek zmierz fluorescencję rezorufiny w studzienkach.

Studzienki pozbawione fluorescencji rezorufiny wskazują na działanie bakteriobójcze związku.

Różna intensywność fluorescencji w studzienkach wskazuje na żywe obciążenie bakteryjne, odzwierciedlając zależną od stężenia siłę bakteriobójczą lub bakteriostatyczną badanych związków.

Zaszczepić polipropylenowe okrągłodenne lub stożkowe probówki wirówkowe zawierające odpowiednio 4 lub 20 mililitrów Middlebrook 7H9-ADN lub 7H9-OADC M. smegmatis przy OD₅₈₀ od 0,01 do 0,1. Inkubować kultury M. smegmatis w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 20%_O2 z wytrząsaniem, rozszerzając kultury do środkowej fazy logarytmicznej lub przybliżonego OD₅₈₀ 0,5.

Aby przeprowadzić eksperyment z minimalnym stężeniem hamującym w warunkach replikacji i bez replikacji, rozprowadź 200 mikrolitrów komórek w 7H9-ADN przy OD₅₈₀ 0,01 do wszystkich dołków 96-dołkowej płytki z czystym dnem poddanej działaniu kultury tkankowej.

W teście niereplikującym należy użyć PBS zawierającego 0,02% tyloksapolu, aby dwukrotnie przemyć komórki i użyć pożywki niereplikującej do ponownego zawieszenia komórek. Użyć pożywki niereplikującej, aby rozcieńczyć komórki do OD₅₈₀ 0,1 i dodać azotyn sodu do końcowego stężenia 0,5 do 5 milimolów ze świeżo przygotowanego 1 molowego bulionu.

Rozprowadzić 200 mikrolitrów komórek o średnicy zewnętrznej₅₈₀ 0,1 do wszystkich studzienek 96-dołkowej płytki z przezroczystym dnem poddanej kulturze tkankowej. Po przygotowaniu agentów testowych zgodnie z protokołem tekstowym dodać 2 mikrolitry agenta testowego #1 do rzędów od A do E i 2 mikrolitry agenta testowego #2 do rzędów od E do H i dokładnie wymieszać.

W przypadku testów replikacyjnych inkubuj mikropłytki M. smegmatis w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 20%_O2 i 5% CO₂ przez 1 do 48 godzin. W punktach czasowych, w których CARA będzie używana jako odczyt, należy użyć pipety wielokanałowej P200 o pojemności od 50 do 75 mikrolitrów, aby ostrożnie ponownie zawiesić zawartość studzienki na płytce testowej typu MIC90, pipetując w górę i w dół od 5 do 10 razy. Następnie za pomocą końcówek pipet delikatnie zawiruj zawartość studzienek okrężnymi ruchami.

Przenieść 10 mikrolitrów zawartości nierozcieńczonej studzienki testowej do odpowiednich dołków mikropłytki CARA, unikając rozpryskiwania podczas przenoszenia i upewniając się, że 10-mikrolitrowa podwielokrotność zostanie zauważona w środku studzienek mikropłytki CARA. Za pomocą taśmy klejącej zwiąż stosy mikropłytek CARA, a następnie umieść je w zamykanej plastikowej torbie. Inkubować mikropłytki M. smegmatis CARA w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 20%_O2 przez jeden do dwóch dni w przypadku replikacji płytek i przez dwa do trzech dni w przypadku płytek niereplikujących.

Gdy w studzienkach kontroli ujemnej widoczny jest film wzrostu bakterii lub większe makroskopowe kolonie, należy użyć pojedynczego zestawu 12 końcówek P200 z pipetą wielokanałową, aby dozować 40 mikrolitrów sterylnego PBS wzdłuż boku studzienek i pozwolić PBS rozprowadzić się po górnej części mikrokolonii bakteryjnych agaru.

Przygotować odczynnik wywołujący CARA, mieszając 5 miligramów rezazuryny i 50 mililitrów 5% Tween-80 w PBS. Dodać 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego odczynnika wywołującego CARA do każdego dołka mikropłytki CARA. Następnie kilkakrotnie kołysz płytkami w przód iw tył, aby pomóc rozprowadzić odczynnik po agarze i macie bakteryjnej w każdym dołku. Umieść płytki w zamykanej plastikowej torbie i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut w poszukiwaniu M. smegmatis.

Przed odczytem fluorescencji należy umieścić mikropłytki CARA w okapie bezpieczeństwa biologicznego na 15 minut w temperaturze pokojowej ze zdjętymi pokrywkami. W przypadku korzystania ze spektrofotometrów BSL3 na zewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego, przyklej naklejkę PCR o jakości optycznej na płytce i użyj miękkiego ręcznika papierowego, aby szczelnie uszczelnić, delikatnie naciskając na powierzchnię naklejki. Określ fluorescencję za pomocą odczytu od góry ze wzbudzeniem na 530 nanometrach i emisją na 590 nanometrach.