JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 4:08 min. • July 8th, 2025
Weź probówki zawierające makrofagi reporterowe z genem wydzielania embrionalnej fosfatazy alkalicznej lub enzymu SEAP pod indukowalnym promotorem.
W jednej probówce wprowadzić przeciwciało specyficzne dla makrofagów Toll-like receptor 2 lub TLR2, neutralizując jego aktywność.
W innym dodaj inhibitor, aby stłumić sygnalizację TLR4. Ostatnią tubkę należy pozostawić nieleczoną.
Weźmy szkiełko z komorą z zaadsorbowaną warstwą wzorów molekularnych związanych z uszkodzeniem lub DAMP - białek uwalnianych podczas martwicy komórek.
Dodaj poddane działaniu i niepoddane działaniu substancji makrofagi w oddzielnych studzienkach i inkubuj.
TLR2 i TLR4 na nieleczonych makrofagach wiążą się z DAMPs, aktywując czynniki transkrypcyjne czynnika jądrowego kappa-B lub NF-κB i białka aktywatora-1 lub AP-1.
Przemieszczają się one do jądra i wiążą się z promotorem SEAP, regulując w górę produkcję SEAP, która jest wydzielana zewnątrzkomórkowo.
Przenieść supernatant zawierający SEAP na mikropłytkę z substratem chromogenicznym.
SEAP hydrolizuje podłoże, wytwarzając produkt o fioletowo-niebieskim kolorze. Zmierzyć absorbancję.
Neutralizacja TLR2 silnie zmniejsza produkcję SEAP, wskazując TLR2 jako główny med
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych