JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 4:08 min. • July 8th, 2025
Weź probówki zawierające makrofagi reporterowe z genem wydzielania embrionalnej fosfatazy alkalicznej lub enzymu SEAP pod indukowalnym promotorem.
W jednej probówce wprowadzić przeciwciało specyficzne dla makrofagów Toll-like receptor 2 lub TLR2, neutralizując jego aktywność.
W innym dodaj inhibitor, aby stłumić sygnalizację TLR4. Ostatnią tubkę należy pozostawić nieleczoną.
Weźmy szkiełko z komorą z zaadsorbowaną warstwą wzorów molekularnych związanych z uszkodzeniem lub DAMP - białek uwalnianych podczas martwicy komórek.
Dodaj poddane działaniu i niepoddane działaniu substancji makrofagi w oddzielnych studzienkach i inkubuj.
TLR2 i TLR4 na nieleczonych makrofagach wiążą się z DAMPs, aktywując czynniki transkrypcyjne czynnika jądrowego kappa-B lub NF-κB i białka aktywatora-1 lub AP-1.
Przemieszczają się one do jądra i wiążą się z promotorem SEAP, regulując w górę produkcję SEAP, która jest wydzielana zewnątrzkomórkowo.
Przenieść supernatant zawierający SEAP na mikropłytkę z substratem chromogenicznym.
SEAP hydrolizuje podłoże, wytwarzając produkt o fioletowo-niebieskim kolorze. Zmierzyć absorbancję.
Neutralizacja TLR2 silnie zmniejsza produkcję SEAP, wskazując TLR2 jako główny mediator.
Aby ocenić wpływ zaadsorbowanej warstwy białkowej na aktywność NF-kB / AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego, po wyhodowaniu makrofagów reporterowych w kolbie o odpowiedniej wielkości do 70% konfluencji, należy odłączyć komórki odpowiednim roztworem dysocjacji enzymatycznej, jak pokazano.
Ponownie zawiesić komórki w stężeniu 7,3 x 105 komórek na mililitr w pożywce testowej i równomiernie podzielić komórki między trzema probówkami. Traktuj pierwszą probówkę komórek jednym mikrogramem na mililitr inhibitora TLR4 przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Traktować drugą probówkę 50 mikrogramami na mililitr przeciwciała anty-TLR2 przez 30 minut w temperaturze pokojowej i pozostawić trzecią probówkę w temperaturze pokojowej bez leczenia.
Podczas inkubacji komórek dodaj 200 mikrolitrów lizatu i 10% płodowej surowicy bydlęcej do trzech lepkich studzienek na warunek. Pozwolić białkom na adsorpcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez odpowiedni okres doświadczalny przed zasysaniem roztworów białkowych za pomocą nowej pipety Pasteura dla każdej studzienki i trzykrotnym myciem lepkich powierzchni studzienki 250 mikrolitrami PBS na studzienkę, przez 5 minut na płukanie.
Pod koniec leczenia makrofagami reporterowymi dodaj 200 mikrolitrów roztworu komórkowego do każdej studzienki. Dodaj Pam3CSK4 do końcowego stężenia 150 nanogramów na mililitr do dwóch studzienek jako kontrolę dodatnią TLR2, jak pokazano na schemacie.
W celu kontroli pozytywnej TLR4 dodaj lipopolisacharyd do końcowego stężenia 1,5 mikrograma na mililitr do dwóch studzienek. Po 20 godzinach w temperaturze 37 stopni Celsjusza rozpylić 20 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki w dwóch egzemplarzach na 96-dołkowej płytce, w tym trzy studzienki z 20 mikrolitrami pożywki do oznaczania na studzienkę jako kontrolę tła.
Następnie dodaj 200 mikrolitrów odczynnika reporterowego SEAP do każdej studzienki i przykryj płytkę uszczelką samoprzylepną na 2 i 1/2 godziny inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieść pozostałą część supernatantu do jednej 1,5-mililitrowej probówki na lepką studzienkę i rozprowadzić zanieczyszczenia przez odwirowanie. Następnie przenieś supernatanty do nowych 1,5-mililitrowych probówek do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu dalszej analizy cytokin prozapalnych metodą ELISA. Pod koniec inkubacji zdjąć uszczelkę adhezyjną z płytki i odczytać absorbancję na czytniku płytek przy 635 nanometrach.