JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 5:54 min • July 8th, 2025
Weź wielodołkową płytkę zawierającą mysie fibroblasty w pożywce pozbawionej surowicy. Dodaj seryjne rozcieńczenia przeciwciał specyficznych dla TNFα.
Dodaj TNFα — cytokinę zapalną.
Inkubować. Deprywacja surowicy indukuje stres komórkowy, czyniąc komórki podatnymi na apoptozę za pośrednictwem TNFα.
TNFα wiązanie się ze swoimi receptorami na komórkach pozbawionych surowicy wyzwala wewnątrzkomórkowe kaskady sygnałowe, aktywując kaskadę kaspazy i indukując apoptozę.
Jednak wiązanie przeciwciała z TNFα zapobiega wiązaniu się z receptorem, hamując aktywację kaspazy.
Po inkubacji dodać mieszaninę odczynników zawierającą detergent, proluminescencyjny substrat kaspazy i enzym lucyferazy wraz z jonami ATP i magnezu. Wymieszać i inkubować.
Detergent przenika przez błony, uwalniając kaspazy z komórek indukowanych przez TNFα.
Podłoże bioluminescencyjne zawiera miejsce rozpoznawania kaspazy. Specyficzne kaspazy rozszczepiają substrat, wytwarzając aminolucyferynę.
Lucyferazy utlenia swój substrat, aminoluzyferynę, powodując emisję światła.
Zmierz intensywność luminescencji, aby wykryć spadek luminescencji wraz ze wzrostem stężenia przeciwciał, wskazując na siłę działania przeciwciał specyficznych dla TNFα w neutralizowaniu TNFα i zapobieganiu apoptozie indukowanej przez TNFα.
Dodać 50 mikrolitrów zawiesiny komórek do wewnętrznych 60 dołków płytki testowej, zaczynając od kolumny 2 do 11. Wymieszać zawiesinę komórkową przez pipetowanie w celu dodania podwielokrotności do mikropłytki. Natychmiast przenieść 50 mikrolitrów zmapowanych rozcieńczeń na płytkę testową.
W przypadku równoległych torów dozować rozcieńczenia, obracając mikropipetę. Zmapowane rozcieńczenia można dozować do studzienek w następującej kolejności. Kontrole są dozowane w otaczających studniach.
Rozcieńczyć TNF-alfa w 500 mikrolitrach ultraczystej wody. Wymieszać za pomocą mieszalnika wirowego z prędkością 2 200 obr./min. Przenieść do probówki o pojemności 15 ml, a na koniec rozcieńczyć do 40 nanogramów na ml za pomocą pożywki do oznaczania. Dozować 50 mikrolitrów roztworu indukcji apoptozy do 60 wewnętrznych studzienek zewnętrznych. Dozować mikrolitry roztworu indukcji apoptozy do 60 wewnętrznych dołków testowych. Na koniec inkubuj przez 16 godzin.
Piątego dnia należy rozpuścić substrat w roztworze buforowym zgodnie z zaleceniami producenta. Wymieszaj, odwracając pięć razy. Dozować roztwór substratu i dodać 50 mikrolitrów roztworu substratu do każdej studzienki próbki na płytce testowej. Dodaj również podłoże do kontrolek. Mieszać test w mieszalniku wirowym przy 400 obr./min przez trzy minuty.
Wyjąć płytkę do oznaczania z mieszalnika i inkubować w temperaturze pokojowej. Włącz spektrofotometr z czytnikiem płytek. Otwórz oprogramowanie Softmax Pro lub inny równoważny program. Załaduj mikropłytkę do spektrofotometru i dostosuj następujące parametry.
Aktywuj funkcję luminescencji na typie zestawu w funkcję punktu końcowego. Dostosuj obszar platformy z wyłączeniem kolumn 1 i 12. Wybierz typ płytki na standardową mikropłytkę z przezroczystym dnem z 96 dołkami. Zmień czas integracji do 1250 milisekund. Dostosuj czas potrząsania mikropłytką do 10 sekund. Należy wybrać ścianę, w której zostanie umieszczona substancja odniesienia, substancja analityczna i próbka kontrolna. Zacznij czytać.