JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 5:54 min. • July 8th, 2025
Weź wielodołkową płytkę zawierającą mysie fibroblasty w pożywce pozbawionej surowicy. Dodaj seryjne rozcieńczenia przeciwciał specyficznych dla TNFα.
Dodaj TNFα — cytokinę zapalną.
Inkubować. Deprywacja surowicy indukuje stres komórkowy, czyniąc komórki podatnymi na apoptozę za pośrednictwem TNFα.
TNFα wiązanie się ze swoimi receptorami na komórkach pozbawionych surowicy wyzwala wewnątrzkomórkowe kaskady sygnałowe, aktywując kaskadę kaspazy i indukując apoptozę.
Jednak wiązanie przeciwciała z TNFα zapobiega wiązaniu się z receptorem, hamując aktywację kaspazy.
Po inkubacji dodać mieszaninę odczynników zawierającą detergent, proluminescencyjny substrat kaspazy i enzym lucyferazy wraz z jonami ATP i magnezu. Wymieszać i inkubować.
Detergent przenika przez błony, uwalniając kaspazy z komórek indukowanych przez TNFα.
Podłoże bioluminescencyjne zawiera miejsce rozpoznawania kaspazy. Specyficzne kaspazy rozszczepiają substrat, wytwarzając aminolucyferynę.
Lucyferazy utlenia swój substrat, aminoluzyferynę, powodując emisję światła.
Zmierz intensywność luminescencji, aby wykryć spadek luminescencji wraz ze wzrostem stężenia przeciwciał, wskazując na siłę działania przeciwciał specyficznych
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych