Technika barwienia tetramerów peptydowych MHC-I do analizy komórek T pamięci CD8 + specyficznych dla SIV
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 4:25 min. • July 8th, 2025
Weźmy komórki jednojądrzaste krwi obwodowej naczelnych lub PBMC zawierające limfocyty T pamięci CD8 + przeciwko małpiemu wirusowi niedoboru odporności lub SIV.
Dodaj inhibitor kinazy białkowej, aby zapobiec internalizacji receptora limfocytów T lub TCR po kolejnej stymulacji.
Wprowadź kompleks zgodności tkankowej peptyd-major klasy I lub tetramery pMHC-I, kompleksy sprzężone z fluoroforem składające się z czterech cząsteczek MHC-I związanych z peptydami specyficznymi dla SIV. Peptydy te wiążą się z TCR na powierzchni limfocytów T.
Dodaj mieszaninę zawierającą przeciwciała sprzężone z fluoroforem wiążące się z CD8, CD28 i CCR7 - markery wyznaczające podzbiory limfocytów T pamięci - oraz przeciwciała znakujące komórki inne niż CD8 +.
Fluorescencyjny barwnik żywotności oznacza martwe komórki.
Napraw komórki. Uodparniaj je, aby uzyskać dostęp do celów wewnątrzkomórkowych.
Dodaj przeciwciała sprzężone z fluoroforem wiążące CD3, marker limfocytów T i wewnątrzkomórkowy granzym B, aktywowany marker limfocytów T CD8 +.
Za pomocą cytometrii przepływowej wyklucz limfocyty T inne niż CD8 + i martwe komórki.
Bramka tetramerów pMHC-I T CD8 + w celu scharakteryzowania różnych podzbiorów limfocytó
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych