Kwantyfikacja masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków

Autofagia masowa polega na sekwestracji ładunku autofagicznego i rozpuszczalnych białek cytozolowych, w tym dehydrogenazy mleczanowej lub LDH, w autofagosomach w celu degradacji.

Aby ocenić sekwestrację LDH, odzwierciedlającą masową aktywność autofagiczną, należy pobrać kuwetę do elektroporacji z komórkami pozbawionymi składników odżywczych potraktowanymi inhibitorami w celu zablokowania degradacji autofagiczno-lizosomalnej.

Wykonaj elektroporację, aby selektywnie rozerwać błonę komórkową i uwolnić rozpuszczalne białka.

Wymieszaj rozpad komórki z buforowanym roztworem sacharozy, aby zachować składniki komórkowe.

Przenieść wymagany rozcieńczony roztwór zakłócający do probówki zawierającej bufor. Odwirować w celu oddzielenia niesekwestrowanego LDH od LDH sekwestrowanego autofagosomem.

Przenieść pozostały rozcieńczony roztwór zakłócający, zawierający całkowitą komórkową frakcję LDH, do innej probówki.

Dodaj niejonowy bufor zawierający środek powierzchniowo czynny do obu probówek, aby wyekstrahować sekwestrowane i całkowite frakcje LDH.

Odwirować i przenieść supernatanty zawierające LDH do probówek zawierających bufor z pirogronianem i NADH.

LDH przekształca pirogronian w mleczan z utlenianiem NADH, zmniejszając poziomy NADH korelujące ze stężeniem LDH.

Określ ilościowo LDH w sedymentowanych i całkowitych frakcjach komórkowych, aby określić sekwestrację LDH.

Za pomocą pipety ponownie zawiesić osad komórek, aby uzyskać zawiesinę prawie jednokomórkową. Przenieś tę zawiesinę do 4-milimetrowej kuwety do elektroporacji. Umieść kuwetę w elektroporatorze fali rozpadu wykładniczego i wyładuj pojedynczy impuls elektryczny o napięciu 800 woltów, 25 mikrofaradach i 400 omach.

Za pomocą nowej końcówki pipety przenieś komórkę, rozrywając ją, do 1,5-milimetrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej 400 mikrolitrów lodowatego roztworu sacharozy buforowanego fosforanem i krótko wymieszaj pipetując. Powtórzyć ten proces ponownego zawieszania, rozrywania elektrod i mieszania dla każdej próbki. Jeśli wykonujesz zabieg po raz pierwszy, upewnij się, że sprawdziłeś skuteczne i selektywne rozerwanie elektrody błony plazmatycznej zgodnie z opisem w tekście.

Aby uzyskać osadzone frakcje LDH, należy usunąć 550 mikrolitrów z każdego rozcieńczonego roztworu z przerwanymi komórkami i przenieść go do własnej 2-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 900 mikrolitrów lodowatego buforu do zawieszania o zawartości 0,5% BSA i 0,01% Tween-20. Krótko odpipetować do wymieszania. Wirować przy 18 000 razy g i 4 stopnie Celsjusza przez 45 minut, aby uzyskać granulki zawierające osadzony LDH. Za pomocą odsysania dokładnie odessać supernatant, aby pozostawić granulki tak suche, jak to możliwe.

Przechowuj osadzone próbki LDH w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu, gdy będą gotowe do analizy. Aby uzyskać całkowite frakcje LDH, przenieś 150 mikrolitrów z każdego z rozcieńczonych roztworów rozerwanych przez komórki do własnej nowej probówki. Przechowuj je w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do analizy.

Rozmrozić zarówno osadzony LDH, jak i wszystkie próbki LDH na lodzie. Po rozmrożeniu dodać 300 mikrolitrów lodowatego buforu do sporządzania zawiesiny zawierającego 1,5% Triton X-405 do całkowitych próbek LDH. Obracaj próbki na wałku w chłodnym pomieszczeniu przez 30 minut. Następnie dodaj 750 mikrolitrów lodowatego buforu do zawieszania zawierającego 1% Triton X-405 do osadzonych próbek LDH. Za pomocą pipety ponownie zawiesić granulki, aż roztwór będzie jednorodny. Odwiruj wszystkie próbki w temperaturze 18 000 razy g w 4 stopniach Celsjusza przez pięć minut, aby osadzać nierozpuszczone resztki komórkowe.

Po zakończeniu wirowania umieścić próbki na lodzie. Oznaczyć poziomy LDH w supernatantach za pomocą klasycznego testu enzymatycznego, jak opisano w tekście, lub dowolnego z szerokiej gamy dostępnych na rynku zestawów.