JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 4:33 min. • July 8th, 2025
Autofagia masowa polega na sekwestracji ładunku autofagicznego i rozpuszczalnych białek cytozolowych, w tym dehydrogenazy mleczanowej lub LDH, w autofagosomach w celu degradacji.
Aby ocenić sekwestrację LDH, odzwierciedlającą masową aktywność autofagiczną, należy pobrać kuwetę do elektroporacji z komórkami pozbawionymi składników odżywczych potraktowanymi inhibitorami w celu zablokowania degradacji autofagiczno-lizosomalnej.
Wykonaj elektroporację, aby selektywnie rozerwać błonę komórkową i uwolnić rozpuszczalne białka.
Wymieszaj rozpad komórki z buforowanym roztworem sacharozy, aby zachować składniki komórkowe.
Przenieść wymagany rozcieńczony roztwór zakłócający do probówki zawierającej bufor. Odwirować w celu oddzielenia niesekwestrowanego LDH od LDH sekwestrowanego autofagosomem.
Przenieść pozostały rozcieńczony roztwór zakłócający, zawierający całkowitą komórkową frakcję LDH, do innej probówki.
Dodaj niejonowy bufor zawierający środek powierzchniowo czynny do obu probówek, aby wyekstrahować sekwestrowane i całkowite frakcje LDH.
Odwirować i przenieść supernatanty zawierające LDH do probówek zawierających bufor z pirogronianem i NADH.
LDH przekształca pirogronian w mleczan z utl
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych