JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:53 min • July 8th, 2025
Weźmy płytkę wielodołkową z różnymi makrofagami reporterowymi, w których znajduje się wydzielany gen embrionalnej fosfatazy alkalicznej lub gen SEAP lub wydzielany gen lucyferazy pod indukowalnymi promotorami.
Dodaj pożywki zawierające różne hybrydy nanocząstek peptydu i złota zmieszane z lipopolisacharydami lub LPS do wyznaczonych studzienek.
LPS wiąże się z receptorami toll-podobnymi makrofagów lub TLR, wywołując internalizację do endosomu.
Endosomalna pompa protonowa transportuje protony do środka. Zakwaszenie wyzwala sygnalizację TLR, aktywując czynniki transkrypcyjne.
Czynniki te indukują ekspresję genów reporterowych, wytwarzając SEAP lub lucyferazę.
Alternatywnie, internalizacja LPS wraz z hybrydami powoduje, że ujemnie naładowane grupy peptydowe sekwestrują protony luminalne, zapobiegając zakwaszeniu endosomalny i hamując sygnalizację TLR.
Zebrać pożywkę, odwirować w celu oddzielenia supernatantu i dodać substraty do SEAP i lucyferazy.
SEAP przekształca swój substrat w kolorowy produkt, podczas gdy lucyferazy katalizuje swój substrat w celu wytworzenia luminescencji.
Zmniejszenie liczby sygnałów reporterowych wskazuje na skuteczność hybryd w hamowaniu sygnalizacji TLR.
Odwirować 20 objętości hybrydowego roztworu peptydu-GNP w 1,5-mililitrowych probówkach eppendorfa o masie 18 000 g przez 30 minut. Ostrożnie wyrzucić supernatanty. Przenieś hybrydy do jednej świeżej probówki i umyj je dwukrotnie 1 mililitrem PBS. Następnie ponownie zawieś umyte hybrydy w jednej objętości podłoża R10. Wymieszać równe objętości skoncentrowanych hybryd i pożywki zawierającej R10 zawierającej LPS tak, aby końcowe stężenie hybryd i LPS wynosiło odpowiednio 100 stu nanomolowych i 10 nanogramów na mililitr.
Następnie usuń pożywkę hodowlaną z płytki do hodowli makrofagów. Dodaj 100 mikrolitrów mieszaniny hybrydowej LPS do każdej studzienki z trzema powtórzeniami dla każdego warunku. Obejmują kontrolę ujemną i kontrolę LPS. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny, a następnie przenieść pożywkę z każdej studzienki do oddzielnej probówki wirówkowej. Odwirować probówki z prędkością 18 000 g w 4 stopniach Celsjusza przez 30 minut. Przenieść supernatanty do świeżej 96-dołkowej okrągłej płytki dennej.
Aby rozpocząć test reporterowy na tych próbkach, dodaj 180 mikrolitrów wstępnie podgrzanego roztworu QUANTI-Blue do każdej studzienki nowej 96-dołkowej płytki z płaskim dnem, a następnie przenieś 20 mikrolitrów supernatantów z każdej próbki do tej płytki. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin, aż ciemnoniebieski kolor rozwinie się do gęstości optycznej powyżej 1. Następnie użyj czytnika płytek, aby zarejestrować absorpcję przy 655 nanometrach. Następnie przenieś 10 mikrolitrów świeżego supernatantu z każdej próbki na 96-dołkową przezroczystą białą płytkę o płaskim dnie.
Za pomocą automatycznego wstrzykiwacza dodaj 50 mikrolitrów roztworu lucyferazy do każdej studzienki i natychmiast zapisz luminescencję dobrze po dołku. Następnie zweryfikuj działanie hamujące potencjalnych kandydatów i oceń swoistość TLR, jak opisano w protokole tekstowym.