Test skupiający się do ilościowego określania mian wirusa w narządach zakażonej myszy

Pobrać płytkę wielodołkową zawierającą monowarstwę komórek ssaków.

Zaszczepić studzienki seryjnymi rozcieńczeniami homogenatów tkankowych zawierających wirusa Zika, pochodzących z różnych narządów zakażonej myszy.

Po dostaniu się do komórek poprzez endocytozę wirus namnaża się i pączkuje, aby zainfekować sąsiednie komórki.

Nakład z roztworem metylocelulozy o wysokiej lepkości, tworząc fizyczną barierę ograniczającą przemieszczanie się wirusa.

Bariera pozwala na infekcję tylko bezpośrednio sąsiadujących komórek, tworząc ogniska zainfekowanych komórek i zapewnia, że każde ognisko pochodzi z pojedynczej cząsteczki wirusa, umożliwiając dokładną kwantyfikację.

Napraw komórki i przepuszczalność błony. Dodaj przeciwciała pierwszorzędowe, które dostają się do komórek i wchodzą w interakcję z antygenem wirusowym.

Wprowadzić przeciwciało drugorzędowe sprzężone z peroksydazą, które wiąże się z przeciwciałem pierwszorzędowym.

Dodaj chromogenny substrat, który jest przekształcany przez peroksydazę, tworząc kolorowe plamy, wskazujące ogniska zainfekowanych komórek.

Policz ogniska, aby określić ilościowo miano wirusa w różnych narządach myszy.

Wyjmij homogenizowane próbki z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i pozwól im się rozmrozić. Mając próbki na lodzie, rozcieńczyć wirusa Zika 10-krotnie do pierwszego dołka płytki rozcieńczającej i użyć pipety wielokanałowej, aby wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia w dół płytki, zmieniając końcówki za każdym razem, dodając 20 mikrolitrów próbki do 180 mikrolitrów pożywki wzrostowej.

Wymieniać końcówki pipet między każdym rozcieńczeniem. Przygotować płytkę tworzącą ognisko, usuwając pożywkę z przygotowanej płaskiej 96-dołkowej płytki przykrywającej komórki Vero. Aby zapobiec wysychaniu monowarstwy, natychmiast dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczenia wirusa do każdej studzienki na płytce Vero. Użyj tego samego zestawu wskazówek, aby dodać od najniższego do najwyższego stężenia.

Płyty skalne boki na boki 2 do 4 razy i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez jedną do dwóch godzin. Rozgrzej 2% metylocelulozy do temperatury pokojowej. Następnie rozcieńczyć 2% roztwór metylocelulozy w pożywce wzrostowej w stosunku około 2 do 1. Po inkubacji dodać 125 mikrolitrów pożywki wzrostowej metylocelulozy do każdej studzienki z 96-dołkowych płytek. Inkubować ponownie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 32 do 40 godzin.

Aby utrwalić komórki Vero, w komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 50 mikrolitrów 5% paraformaldehydu na wierzch warstwy metylocelulozy w każdym dołku z 96-dołkowych płytek. Inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Alternatywnie przykryj płytki parafilmem i umieść je na noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Następnie za pomocą pipety usuń nakładkę i media z komórek do jednorazowego pojemnika wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego. Umyć delikatnie 150 mikrolitrami PBS na studzienkę. Usuń PBS z płytek i wyjmij płytkę z szafy bezpieczeństwa biologicznego. Powtórz pranie PBS dwukrotnie. Następnie dodaj 150 mikrolitrów na studzienkę jeden raz bufor do płukania FFA i pozostaw w temperaturze pokojowej na 5 do 10 minut, aby przepuszczalność utrwalonych komórek.

Następnie użyj pierwotnego przeciwciała Zika do wykrycia infekcji. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe 4G2 w stężeniu 1 mikrograma na mililitr w buforze barwiącym FFA. Zetrzyj bufor płuczący FFA z płytek i dodaj 50 mikrolitrów pierwszorzędowego przeciwciała w buforze barwiącym FFA do każdej studzienki. Następnie uszczelnij płytki parafilmem lub folią z tworzywa sztucznego i inkubuj przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Przygotować wtórne kozie przeciwciało anty-mysie znakowane HRP w stężeniu od 1 do 5,000 w buforze barwiącym FFA. Po usunięciu roztworu przeciwciała przemyj komórki trzykrotnie 150 mikrolitrami buforu płuczącego FFA na studzienkę. Wyjmij bufor do mycia, za każdym razem wsuwając go do zlewu.

Wybarwić komórki przeciwciałem wtórnym w buforze barwiącym FFA w ilości 50 mikrolitrów na studzienkę i inkubować od jednej do dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie umyj komórki trzykrotnie buforem do płukania FFA, usuwając bufor do mycia, za każdym razem wrzucając go do zlewu.

Dodaj 50 mikrolitrów substratu Trueblue do każdej studzienki. Poczekaj od 2 do 15 minut, aż plamy zostaną w pełni zdefiniowane z minimalnym tłem. Po wyświetleniu plam delikatnie umyj je wodą, używając dłoni, aby osłonić monowarstwę przed siłą płynącej wody. Osuszyć na ręcznikach papierowych.

Wkrótce potem użyj lunety preparacyjnej, aby ręcznie policzyć plamy w każdej studzience lub użyj automatycznego licznika punktowego. W oprogramowaniu do wychwytywania immunologicznego wybierz rozcieńczenie z łatwo rozróżniającymi ogniskami od 20 do 200 na studzienkę dla każdej próbki i oblicz miano w jednostkach tworzących ognisko na mililitr, korzystając ze średniej z duplikatów dołków.