Wpływ naprężenia ścinającego na płytki krwi leczone przeciwciałami przeciwko receptorom mechanosensorycznym

Rozpocząć od płytki wielodołkowej zawierającej osocze bogatopłytkowe. Płytki krwi wyrażają powierzchniowe kompleksy mechanoreceptorowe — reagujące na bodźce mechaniczne.

Kompleks mechanoreceptorowy zawiera zewnątrzkomórkową domenę wiążącą ligand i region makroglikopeptydu połączony z domeną mechanosensoryczną.

Wprowadzić przeciwciała antymechanoreceptorowe, sieciując się z domenami wiążącymi ligand receptorów na przeciwległych płytkach krwi.

Umieścić kroplę zawiesiny osocza poddanej działaniu przeciwciał między zespołami lepkościomierzu.

Zastosuj naprężenie ścinające, symulując siłę mechaniczną, odciągając receptory związane z przeciwciałami od płytek krwi, co prowadzi do dysocjacji regionu makroglikopeptydu od domeny mechanosensorycznej.

Powoduje to zmianę konformacyjną w domenie mechanosensorycznej, aktywując płytki krwi i powodując ekspresję markerów powierzchniowych.

Przenieść ściętą zawiesinę płytek krwi do nowego dołka w płytce wielodołkowej.

Wprowadzić koktajl znakowanych fluoroforem cząsteczek specyficznych dla markerów, oddziałujących z odpowiednimi markerami powierzchni płytek krwi i utrwalić komórki roztworem utrwalającym.

W cytometrii przepływowej wyraźne sygnały fluorescencyjne korelują z wpływem naprężenia ścinającego na płytki krwi leczone przeciwciałami.

W przypadku leczenia ligandem należy powoli dodawać przeciwciało lub ligand będący przedmiotem zainteresowania do osocza bogatopłytkowego i delikatnie mieszać płytki krwi. Podczas inkubacji włącz lepkościomierz stożkowo-płytkowy i ustaw temperaturę płytki na 22 stopnie Celsjusza. Po 5 do 10 minutach przenieś osocze bogatopłytkowe poddane działaniu substancji na lepkościomierz stożkowy z kontrolowaną temperaturą bezpośrednio na środku płytki, uważając, aby cała próbka została osadzona między stożkiem a płytką w miejscu kontaktu.

Aby zastosować ścinanie do próbki, oblicz ścinanie zgodnie z instrukcją lepkościomierza i zastosuj ścinanie do próbki z odpowiednią szybkością i czasem trwania. Pod koniec aplikacji podnieś stożek około 2 milimetry od płytki, tak aby próbka pozostała w kontakcie zarówno z płytką, jak i stożkiem, a następnie użyj końcówki do pipety z żelem, aby zebrać od 5 do 10 mikrolitrów od środka objętości próbki. Następnie inkubować ściętą próbkę z przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym będącym przedmiotem zainteresowania przez 20 minut w temperaturze pokojowej i utrwalać próbki w 2% paraformaldehydzie przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Aby przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej, zbierz co najmniej 20 000 zdarzeń dla każdego stanu i określ ilościowo siłę sygnału każdego markera fluorescencyjnego, używając wartości wysokości dla intensywności każdego fluoroforu. Następnie należy użyć kontroli ujemnej z albuminą surowicy bydlęcej lub nośnikiem, aby narysować bramkę wykluczającą ujemne zdarzenia fluorescencyjne tła i określić ilościowo procent zdarzeń wewnątrz bramki dla wszystkich warunków eksperymentalnych.