JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:29 min • July 8th, 2025
Pobrać dwie mikropłytki zawierające szkiełka nakrywkowe z makrofagami pochodzącymi ze szpiku kostnego lub BMM.
Dodaj metacykliczne promastigoty Leishmania - wydłużone stadium wiciowców - na jednej płytce i amastigotes - owalne stadium niewiciowe - na drugiej płytce.
Podczas inkubacji pasożyty wiążą się z receptorami makrofagów, wywołując fagocytozę za pośrednictwem receptorów.
Fagosom łączy się z lizosomami i pęcherzykami pochodzącymi z retikulum endoplazmatycznego i aparatu Golgiego, dojrzewając do wakuoli parazytoforowej.
Obniżone pH wakuoli powoduje różnicowanie promastigoty w amastigotę i jej replikację.
Umyj w celu usunięcia niezinternalizowanych pasożytów.
Napraw zainfekowane makrofagi i dodaj detergent, aby przepuszczalność komórek i pasożytów.
Wprowadź fluorescencyjny barwnik kwasu nukleinowego, aby zabarwić makrofagi i jądra pasożytów.
Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych i obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym, określając ilościowo większe jądra gospodarza i otaczając mniejsze jądra amastigotów.
Porównaj liczbę amastigotów, aby ocenić ich namnażanie się w makrofagach początkowo zakażonych niezróżnicowanymi promastigotykami w porównaniu z tymi zakażonymi replikacyjnymi amastigotami.
Aby zainfekować komórki L. amazonensis, należy rozcieńczyć zawiesinę pasożyta do odpowiedniej doświadczalnej wielokrotności infekcji i dodać od 50 do 100 mikrolitrów pasożytów do każdej studzienki ze wszystkich 6-dołkowych płytek, w tym do wszystkich punktów czasowych eksperymentu. Inkubować makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego przez odpowiedni okres infekcji i temperaturę. Następnie umyj studzienki trzykrotnie 2 mililitrami świeżego PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wapnia lub magnezu na studzienkę i utrwal początkowe próbki punktu czasowego za pomocą 1,5 do 2 mililitrów 2% paraformaldehydu przez 10 minut.
W przypadku płytek odpowiadających późniejszym punktom czasowym dodać 2 mililitry świeżej pożywki makrofagowej pochodzącej ze szpiku kostnego do każdej studzienki i zwrócić płytki do odpowiedniego inkubatora. Następnie utrwal i umyj komórki dla każdego pozostałego punktu czasowego, jak właśnie pokazano, i przechowuj próbki w temperaturze 4 stopni Celsjusza w świeżym PBS.
Aby zabarwić komórki DAPI, zastąp supernatant 1,5 mililitra świeżego PBS bez wapnia i magnezu, uzupełniony 0,1% niejonowym detergentem przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wykonaj trzy 2-mililitrowe płukania PBS bez wapnia i magnezu. Następnie wybarwić komórki 2 mikrogramami na mililitr DAPI w 1 mililitrze PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
Po trzech praniach umieść szkiełka nakrywkowe komórką do dołu na pojedynczych szklanych szkiełkach mikroskopowych zamontowanych za pomocą dostępnego w handlu odczynnika zapobiegającego blaknięciu. Następnie, aby określić ilościowo liczbę zainfekowanych komórek, użyj 100-krotnego obiektywu z olejkiem immersyjnym mikroskopu fluorescencyjnego i licznika Emanuela, aby zidentyfikować liczbę mniejszych jąder amastigotów skupionych wokół każdego dużego jądra makrofagów barwionego DAPI.