Test punktowy do oceny reakcji na stres oksydacyjny w szczepach bakteryjnych

Zarówno pyomelaninę, jak i szczepy bakteryjne niewytwarzające pyomelaniny należy traktować środkiem testowym.

Piomelanina, pigment zewnątrzkomórkowy, zapewnia ochronę przed stresem oksydacyjnym.

Badany czynnik zaburza biosyntezę pyomelaniny, zmniejszając jej produkcję.

Po inkubacji przeprowadzić seryjne rozcieńczenia bakteryjne buforem zawierającym badany czynnik lub rozpuszczalnik nośnika.

Punktowe rozcieńczenia bakteryjne na płytkach agarowych o różnych stężeniach nadtlenku wodoru - stresor oksydacyjny.

Płytki pozbawione nadtlenku wodoru służą jako kontrole.

Inkubować. Na płytkach kontrolnych bakterie tworzą kolonie.

W nieleczonym szczepie wytwarzającym pyomelaninę, pyomelanina chroni bakterie przed uszkodzeniem oksydacyjnym wywołanym nadtlenkiem wodoru, co prowadzi do powstania pigmentowanych kolonii.

Jednak szczep wytwarzający pyomelaninę poddany działaniu czynnika testowego, wykazujący zmniejszoną pyomelaninę, staje się wrażliwy na stres oksydacyjny, co prowadzi do śmierci bakterii.

Policz kolonie.

Zmniejszona liczba i wielkość kolonii wraz ze wzrostem stężenia nadtlenku wodoru w traktowanych szczepach wytwarzających pyomelaninę i zarówno poddanych działaniu środka oraz nieleczonych, jak i niewytwarzających piromelaniny w porównaniu z grupą kontrolną wskazują na zwiększoną wrażliwość bakterii na stres oksydacyjny.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy skonfigurować nocne hodowle szczepów, które mają być testowane w LB, z NTBC i bez niego. Następnego dnia przygotuj płytki agarowe LB zawierające nadtlenek wodoru jako stresor oksydacyjny. Najpierw rozpuść kolby agarowe LB i schłodzić podłoże do około 50 stopni Celsjusza w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj nadtlenek wodoru bezpośrednio do schłodzonego medium w żądanych stężeniach. Zamieszaj kolbę, aby wymieszać. Dobrym punktem wyjścia jest zakres stężeń nadtlenku wodoru od 0 do 1 milimola. Natychmiast wlej płytki i podpal powierzchnię, aby usunąć bąbelki. Wydajność wynosi cztery płytki na 100 milimetrów agaru LB. Oznacz płytki stężeniem nadtlenku wodoru.

Umieść płytki odkryte w biologicznym okapie przepływowym, z wentylatorem pracującym przez 30 minut, aby usunąć nadmiar wilgoci z płytek. Talerze należy zużyć w tym samym dniu, w którym zostały przygotowane. Podczas suszenia płytek umyj i zmierz OD600 z nocnych kultur

.

Znormalizować OD600 we wszystkich nocnych kulturach do najniższej wartości dla badanego zestawu szczepów. Aby to zrobić, określ objętość kultury potrzebną do rozcieńczenia kultury do najniższego OD600 w całkowitej objętości 1 mililitra.

Na przykład, jeśli kultura ma OD600 równy 3, a najniższy OD600 dla zestawu szczepów wynosi 2,5, wykonaj następujące obliczenia, co da 0,833 mililitra jako potrzebną objętość kultury. Umieść 0,833 mililitra kultury w probówce do mikrofuge. Następnie oblicz ilość LB plus NTBC lub LB plus DMSO potrzebną do doprowadzenia objętości kultury do 1 mililitra. W tym przykładzie ilość ta wyniesie 0,167 mililitra. Wymieszaj przez wirowanie.

Aby utrzymać kultury w stałym stężeniu NTBC lub DMSO, należy wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia znormalizowanych kultur nocnych w PBS plus NTBC lub PBS plus DMSO. Przygotuj roztwory podstawowe PBS plus NTBC i PBS plus DMSO, skalując się w górę lub w dół, w zależności od liczby testowanych szczepów.

Dla jednego zestawu rozcieńczeń dla jednego szczepu zmieszać 300 mikromolów NTBC lub równoważną objętość DMSO z PBS, aby uzyskać całkowitą objętość 720 mikrolitrów. Dodaj 90 mikrolitrów PBS plus NTBC lub PBS plus DMSO do odpowiednich probówek do mikrofuge oznaczonych na 10 do minus 1 przez 10 do minus 7 rozcieńczeń seryjnych. Dodać 10 mikrolitrów kultury do odpowiednich 10 do minus 1 probówki z rozcieńczeniem.

Wymieszać przez wirowanie i przenieść 10 mikrolitrów 10 do rozcieńczenia minus 1 do probówki z rozcieńczeniem 10 do minus 2. Zmieniając końcówki pipet między rozcieńczeniami, powtarzać tę czynność, aż wszystkie rozcieńczenia zostaną wykonane.

Umieścić 5 mikrolitrów rozcieńczeń od 10 do minus 3 do 10 do minus 7 na płytkach LB plus nadtlenek wodoru w dwóch egzemplarzach dla każdego szczepu. Użyj jednej końcówki pipety, jeśli plamki są platerowane od najbardziej rozcieńczonych do najmniejszych. Nie przechylaj ani nie przechylaj płytki, dopóki płyn nie wyschnie w talerzu. Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przez 24 do 48 godzin, w zależności od szczepu. Gdy pojawią się duże kolonie, sfotografuj płytki za pomocą kamery CCD umieszczonej nad transiluminatorem.