Test biofilmu na płytce kołkowej do badań przesiewowych środków przeciwbakteryjnych

Weź płytkę do mikromiareczkowania z pokrywką z cylindrycznymi podporami lub kołkami, pokrytymi biofilmami bakteryjnymi.

Umieść pokrywkę pokrytą biofilmem na dołkach z płytką do mikromiareczkowania z buforem, aby wyeliminować luźno przyczepione lub planktonowe bakterie, koncentrując się na pomiarach przyczepionych do biofilmu.

Przenieść wypłukaną, pokrytą biofilmem pokrywkę kołkową na płytkę prowokacyjną o rosnącym stężeniu testowego środka przeciwbakteryjnego. Inkubować bez wstrząsania.

W zależności od stężenia i potencjału przeciwbakteryjnego środek zaburza aktywność metaboliczną bakterii i integralność biofilmu.

Po inkubacji umieścić pokrywkę kołka na studzienkach płytkowych zawierających bufor, aby usunąć bakterie planktonowe.

Przenieść go do studzienek na płytce do mikromiareczkowania za pomocą pożywki do odzyskiwania biofilmu zawierającej rezazurynę, przepuszczalny dla komórek, słabo fluorescencyjny barwnik. Inkubować.

U bakterii aktywnych metabolicznie enzymy dehydrogenazy redukują niebieską rezyzynę do różowej, fluorescencyjnej rezorufiny.

Brak konwersji resazuryny wskazuje na eradykację biofilmu, podczas gdy konwersja do rezorufiny sugeruje obecność żywotnych komórek.

Najniższe badane stężenie środka przeciwbakteryjnego bez konwersji resazuryny oznacza minimalne stężenie eliminujące biofilm.

Weź świeżą 96-dołkową płytkę i dodaj 100 mikrolitrów CRPMI zrównoważonych z temperaturą pokojową do każdego dołka w rzędach od B do H. Rozcieńczyć do czterech badanych związków oddzielnie w 1,0 mililitrze CRPMI do 2x pożądanego stężenia końcowego. Dodać 200 mikrolitrów związku numer jeden w studzienkach A1 do A3, 200 mikrolitrów związku drugiego w studzienkach A4 do A6, 200 mikrolitrów związku trzeciego w studzienkach A7 do A9 i 200 mikrolitrów związku czwartego w studzienkach A10 do A12.

Seryjnie rozcieńczyć badane związki za pomocą pipety wielokanałowej. Zacznij od przeniesienia 100 mikrolitrów z rzędu A do rzędu B i wymieszaj. W ten sposób kontynuuj przenoszenie 100 mikrolitrów dobrze do studni. Wymieszaj po każdym przeniesieniu i zatrzymaj w rzędzie F. Po wymieszaniu wyrzuć 100 mikrolitrów z rzędu F do pojemnika na odpady. Nie przelewaj żadnych płynów do rzędów G i H. Na koniec dodaj 100 mikrolitrów CRPMI do każdego dołka płytki za pomocą pipety wielokanałowej, aby doprowadzić końcową objętość do 200 mikrolitrów.

Dodać 200 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do świeżej sterylnej 96-dołkowej płytki, która zawiera studzienki o wymiarach identycznych z wymiarami płytki inicjującej biofilm. Następnie wyjmij plastikową torbę i folię parafinową z inkubowanej płytki inicjującej biofilm. Podnieś pokrywę prosto do góry, unikając kontaktu kołków z dnem płytki, ponieważ może to spowodować uszkodzenie biofilmu. Zachowaj dolną część do późniejszej analizy OD₆₀₀.

Spłukać komórki planktonu, umieszczając wieczko kołka na płytce zawierającej PBS. Zanurz kołki na 5 sekund, wyjmij je z PBS i zanurz ponownie, uważając, aby nie uderzyć kołkami o boki studni. Umieść wypłukaną pokrywkę kołka w talerzu wyzwania. Unikaj niepotrzebnego kontaktu kołków z dolną płytą, ponieważ spowoduje to uszkodzenie biofilmu, prowadząc do niespójnych wyników.

Uszczelnij płytkę folią parafinową i umieść w zamykanej plastikowej torbie, jak poprzednio. Inkubować płytkę bez wstrząsania przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Pobrać dolną część płytki inicjującej biofilm i ponownie zawiesić bakterie w każdej studzience za pomocą pipety wielokanałowej. Zmierzyć średnicę zewnętrzną₆₀₀ za pomocą odpowiedniego czytnika mikropłytek, aby potwierdzić wzrost występujący we wszystkich studzienkach, z wyjątkiem kontroli sterylności w rzędzie H.

Użyć czytnika płytek wyposażonego w komorę inkubacyjną i zdolnego do wykonywania odczytów fluorescencji kinetycznej w celu wykrycia konwersji rezazuryny. Skonfiguruj 24-godzinny pomiar fluorescencji kinetycznej przy użyciu wzbudzenia 530 nm i emisji 590 nm. Ustaw temperaturę komory na 37 stopni Celsjusza i czyń odczyt tabliczki co 20 minut.

Ustaw czytnik płytek tak, aby mierzył od spodu płytki, zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotuj się do umycia płytki, dodając 200 mikrolitrów PBS do każdego dołka sterylnej płytki 96-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej. Następnie przygotuj pożywkę do odzyskiwania biofilmu, dodając 400 mikrolitrów 0,8 miligrama na mililitr roztworu podstawowego rezazuryny do 20 mililitrów pożywki CRPMI, do końcowego stężenia 16 mikrogramów na mililitr rezazuryny.

Następnie dodaj 150 mikrolitrów pożywki do odzyskiwania biofilmu za pomocą pipety wielokanałowej do każdego dołka świeżej 96-dołkowej płytki. Przenieś płytkę prowokacyjną z inkubatora do szafy bezpieczeństwa biologicznego i ostrożnie wyjmij plastikową torbę i folię uszczelniającą. Zdejmij pokrywkę kołka z płytki prowokacyjnej i spłucz komórki planktonowe w PBS, tak jak poprzednio, zachowując dolną część płytki prowokacyjnej do późniejszej analizy OD₆₀₀.

Po spłukaniu umieść pokrywkę kołka w dnie płytki zawierającej pożywkę do odzyskiwania biofilmu. Owiń bok płyty folią parafinową, uważając, aby nie zasłaniać dna studzienek obwodowych. Natychmiast po owinięciu płytki należy umieścić ją na czytniku płytek i rozpocząć odczyt kinetyczny w ciągu 24 godzin, inicjując wcześniej wykonany protokół kinetyczny reazuryny.