Test fluorescencyjny in vitro do pomiaru skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej

Weź mikropłytkę zawierającą komórki ssaków na lodzie.

Do wybranych studzienek dodać pożywkę zawierającą wapń, a do pozostałych pożywkę bez wapnia.

Wprowadź monomery bakteryjnej toksyny tworzącej pory. Niska temperatura zapobiega agregacji monomerów, ułatwiając wiązanie się z cholesterolem błony komórkowej.

Inkubuj w temperaturze fizjologicznej, pozwalając monomerom związanym z cholesterolem na oligomeryzację i wprowadzenie się do błony, tworząc pory.

W studzienkach z wapniem zewnątrzkomórkowym pory powodują napływ wapnia.

Napływ powoduje egzosomalne wydalanie toksyny i ponowne uszczelnienie błony.

Wewnątrzkomórkowy wzrost wapnia indukuje również lizosomalną egzocytozę, uwalniając enzym, który przekształca sfingomielinę błony w ceramid.

Błona wzbogacona ceramidami wyzwala endocytozę toksyn, ponownie uszczelniając błonę.

Ponowne uszczelnienie błony jest utrudnione w studzienkach bez wapnia zewnątrzkomórkowego.

Dodaj jodek propidyny lub PI - barwnik fluorescencyjny - który nie może dostać się do komórek z naprawioną błoną, ale wnika do uszkodzonych komórek, aby związać DNA, emitując fluorescencję.

Mierz fluorescencję w określonych odstępach czasu, aby ocenić skuteczność ponownego uszczelniania membrany.

Aby skonfigurować wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji dla warunków permisywnych naprawy, umyj komórki dwa razy 200 mikrolitrami pożywki M1 o temperaturze 37 stopni Celsjusza na studzienkę i dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki M1 o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionej 30-mikromolowym jodkiem propidyny po odrzuceniu drugiego prania.

W celu naprawy warunków restrykcyjnych należy przemyć ogniwa jednorazowo 200 mikrolitrami pożywki M2 o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionej 5-milimolowym EGTA na studzienkę, a następnie przemyć je jednym myciem 200 mikrolitrami samej pożywki M2.

Po odrzuceniu drugiego prania dodaj 100 mikrolitrów świeżego podłoża M2 o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionego 30-mikromolowym jodkiem propidyny na studzienkę. Następnie zobrazuj płytkę w świetle przechodzącym, GFP i PI, jak właśnie pokazano. Podczas obrazowania płytki umieść 96-dołkową mikropłytkę polipropylenową z okrągłym dnem na lodzie i skonfiguruj płytkę tak, jak właśnie pokazano dla poprzedniej płytki.

W celu naprawy warunków permisywnych dodać 100 mikrolitrów lodowatego podłoża M1 uzupełnionego 60 mikromolowym jodkiem propidyny na studzienkę, a następnie dodać 100 mikrolitrów lodowatego M1 z lub bez 4x listeriolizyny O na studzienkę.

W celu naprawy warunków ograniczających dodać 100 mikrolitrów lodowatego podłoża M2 uzupełnionego 60 mikromolowym jodkiem propidyny na studzienkę, a następnie dodać 100 mikrolitrów lodowatego M2 z lub bez 4x listeriolizyny O na studzienkę.

Konieczne jest przygotowanie listeriolizyny O w odpowiednim stężeniu doświadczalnym na lodzie około 5 minut przed rozpoczęciem próby kinetycznej, gdy tabliczka 1 znajduje się na lodzie, a tabliczka 2 jest przygotowywana.

Po zakończeniu obrazowania pierwszej płytki natychmiast przenieś ją na arkusz folii aluminiowej na lodzie. Po 5 minutach przenieść 100 mikrolitrów z każdej studzienki drugiej płytki do odpowiedniego dołka w pierwszej schłodzonej płytce, wkładając końcówki pipet poniżej menisku roztworu do każdej studzienki przed wyrzuceniem objętości bez mieszania w celu prawidłowego rozprowadzenia toksyny.

Pozwól, aby toksyna związała się z komórkami gospodarza przez 1 minutę i natychmiast przenieś pierwszą płytkę do czytnika płytek w celu przeprowadzenia testu postkinetycznego w trybie spektrofluorometru. Pod koniec testu kinetycznego należy natychmiast uzyskać postkinetyczne obrazowanie obrazu płytki, jak pokazano w przypadku obrazowania prekinetycznego.