Ulepszona metoda immunoprecypitacji sieciowania do skutecznej identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy

Weź świeżo zebrane jądro myszy w schłodzonym buforze. Usuń osłonkę białawą, warstwę tkanki włóknistej.

Potaryzować jądro, aby uwolnić kanaliki nasienne zawierające komórki rozrodcze i Sertoliego.

Dodaj bufor i poddaj kanaliki promieniowaniu UV w celu nieodwracalnego usieciowania RNA z powiązanymi białkami, zachowując interakcje.

Odwirować i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić kanaliki w buforze do lizy zawierającym inhibitory RNazy i proteazy.

Sonizuj tkankę, uwalniając kompleksy białko-RNA i inne składniki wewnątrzkomórkowe. Inhibitory RNaz i proteazy inaktywują endogenne RNazy i proteazy.

Dodaj DNazę, aby zdegradować DNA. Wprowadzić rozcieńczoną RNazę do częściowego trawienia RNA.

Odwirować i przenieść supernatant zawierający kompleksy RNA-białko do roztworu kulek magnetycznych pokrytego przeciwciałem o wysokiej swoistości dla docelowego białka wiążącego RNA.

Zastosuj pole magnetyczne, aby oddzielić kompleksy białko-RNA związane z kulkami. Odrzucić supernatant.

Umyć buforem. Magnetycznie oddziel kompleksy białko-RNA i wykorzystaj je do dalszej analizy interakcji RNA-białko.

Aby rozpocząć tę procedurę, zbierz około 100 miligramów jąder od myszy w odpowiednim wieku do każdego e