Ulepszona metoda immunoprecypitacji sieciowania do skutecznej identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy

Weź świeżo zebrane jądro myszy w schłodzonym buforze. Usuń osłonkę białawą, warstwę tkanki włóknistej.

Potaryzować jądro, aby uwolnić kanaliki nasienne zawierające komórki rozrodcze i Sertoliego.

Dodaj bufor i poddaj kanaliki promieniowaniu UV w celu nieodwracalnego usieciowania RNA z powiązanymi białkami, zachowując interakcje.

Odwirować i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić kanaliki w buforze do lizy zawierającym inhibitory RNazy i proteazy.

Sonizuj tkankę, uwalniając kompleksy białko-RNA i inne składniki wewnątrzkomórkowe. Inhibitory RNaz i proteazy inaktywują endogenne RNazy i proteazy.

Dodaj DNazę, aby zdegradować DNA. Wprowadzić rozcieńczoną RNazę do częściowego trawienia RNA.

Odwirować i przenieść supernatant zawierający kompleksy RNA-białko do roztworu kulek magnetycznych pokrytego przeciwciałem o wysokiej swoistości dla docelowego białka wiążącego RNA.

Zastosuj pole magnetyczne, aby oddzielić kompleksy białko-RNA związane z kulkami. Odrzucić supernatant.

Umyć buforem. Magnetycznie oddziel kompleksy białko-RNA i wykorzystaj je do dalszej analizy interakcji RNA-białko.

Aby rozpocząć tę procedurę, zbierz około 100 miligramów jąder od myszy w odpowiednim wieku do każdego eksperymentu immunoprecypitacji. Umieść chusteczki w lodowatym PBS. Za pomocą pęsety z cienką końcówką delikatnie usuń osłonkę białawą. Dodaj 3 mililitry lodowatego PBS do młynka do chusteczek i użyj luźnego szklanego tłuczka, aby rozcierać tkankę za pomocą łagodnej siły mechanicznej. Następnie przenieś zawiesinę tkankową do naczynia do hodowli komórkowych i dodaj lodowaty PBS do 6 mililitrów. Szybko potrząśnij talerzem, aby płyn równomiernie pokrył dno naczynia.

Trzykrotnie usieciuj zawiesinę na lodzie z prędkością 400 milidżuli na centymetr kwadratowy przy 254 nanometrach. Upewnij się, że wymieszałeś zawiesinę między każdym napromieniowaniem, a następnie zbierz zawiesinę do 15-mililitrowej stożkowej probówki i odwiruj pod ciśnieniem 1200 razy g i w temperaturze 4 stopni przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze PBS. Następnie przenieś zawiesinę do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować w temperaturze 1000 g i 4 stopni Celsjusza przez dwie minuty i wyrzucić supernatant.

Najpierw dodaj 125 mikrolitrów kulek magnetycznych białka A na próbkę do świeżej probówki wirówkowej. Umieść rurkę na magnesie, aby oddzielić kulki od roztworu. Po 10 sekundach usuń supernatant i dwukrotnie umyj kulki 1 mililitrem lodowatego buforu do lizy. Ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach zimnego buforu do lizy z 10 mikrogramami przeciwciała eCLIP. Obracaj probówki w temperaturze pokojowej przez 45 minut, a następnie dwukrotnie umyj kulki 1 mililitrem lodowatego buforu do lizy

Na początek ponownie zawieś granulki tkanek w 1 mililitrze buforu do lizy na zimno zawierającego 22 mikrolitry koktajlu inhibitorów białek 50X wolnych od EDTA i 11 mikrolitrów inhibitora RNAzy. Utrzymuj lizę próbek na lodzie przez 15 minut. Sonicate każda próbka jest opisana w protokole tekstowym. Następnie dodaj 4 mikrolitry DNAzy do każdej probówki i dobrze wymieszaj. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, wstrząsając z prędkością 1,200 obr./min. Następnie dodaj 10 mikrolitrów rozcieńczonego RNAZA i dobrze wymieszaj. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 minut, wstrząsając z prędkością 1,200 obr./min.

Następnie odwirować w temperaturze 15 000 g i w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby usunąć lizat. Ostrożnie zebrać supernatant. Najpierw dodaj 1 mililitr lizatu do przygotowanych kulek i obracaj próbki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez dwie godziny lub noc. Następnie zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i wyrzuć supernatant. Umyj kulki dwukrotnie 900 mikrolitrami buforu o wysokiej zawartości soli, a następnie dwukrotnie umyj kulki 900 mikrolitrami buforu do mycia.