Test cytometrii przepływowej w celu identyfikacji podzbiorów komórek odpornościowych w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej

Weźmy komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub PBMC, populację komórek mieszanych, w tym limfocyty i monocyty.

Dodaj fluorescencyjny barwnik żywotności, aby rozróżnić martwe komórki, oraz fluorescencyjnie znakowany koktajl przeciwciał, aby zidentyfikować różne typy komórek.

Przeciwciała sprzężone z fluorochromem A wiążą się z markerami powierzchniowymi - CD3 na limfocytach T, receptorze limfocytów T γδ lub TCR na limfocytach T γδ i CD56 na komórkach NK lub NK.

Przeciwciała sprzężone z fluorochromem B wiążą się z CD4 i CD8 na limfocytach T, CD19 na komórkach B i CD14 na monocytach.

Za pomocą cytometrii przepływowej zidentyfikuj podzbiory żywych komórek.

Podczas gdy limfocyty T CD8 ⁺ i CD4 ⁺ są CD3 ⁺, komórki CD4 ⁺ leżą między komórkami pojedynczymi dodatnimi CD3 i podwójnie dodatnimi CD3-CD8.

Limfocyty T γδ wyrażają γδ TCR i wyższe CD3 w porównaniu z komórkami CD4 ⁺ i CD8 ⁺.

Limfocyty B i komórki NK są CD3^-, ale są identyfikowane przez CD19 na komórkach B i CD56 na komórkach NK.

Monocyty identyfikuje się na podstawie ekspresji CD14.

Aby przygotować PBMC do barwienia, należy przenieść 100 mikrolitrów każdej próbki na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V. Odwirować płytkę w temperaturze 350 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odessać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Do każdego dołka dodać 100 mikrolitrów PBS zawierającego żywy/martwy barwnik utrwalalny, który reaguje z wolnymi aminami na białkach, i ostrożnie ponownie zawiesić mieszaninę PBMC.

Następnie pozostaw płytkę na 10 minut w temperaturze pokojowej w celu oznaczenia martwych komórek. Dla każdej próbki należy przygotować 30 mikrolitrów mieszanki zawierającej wszystkie siedem przeciwciał. Na tym etapie można również dodać przeciwciała miareczkowane przeciwko różnym cząsteczkom docelowym i w różnych fluorochromach. Odwirować 96-dołkową płytkę o masie 350 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu komórkowego.

Dodaj koktajl przeciwciał do każdej studzienki i ostrożnie zawieś ponownie, nie wytwarzając pęcherzyków. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po 30 minutach dodaj 150 mikrolitrów buforu barwiącego do każdej studzienki i odwiruj płytkę w temperaturze 350 razy g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach PBS. Komórki są teraz gotowe do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Aby rozpocząć tę strategię bramkowania z dwoma fluorochromami, siedmioma markerami, wybierz bramkę limfocytów i utwórz wykres kropkowy z jednym z dwóch fluorochromów używanych w tym protokole na każdej osi. Bramka na CD8-dodatnich limfocytach T, zidentyfikowanych jako podwójnie dodatnie komórki CD3 i CD8 w prawym górnym rogu wykresu kropkowego. Wyklucz populację dim CD8, która może zawierać limfocyty NK T. Brama na limfocytach T CD4-dodatnich, zidentyfikowana jako populacja pomiędzy limfocytami T CD8-dodatnimi a populacjami pojedynczymi dodatnimi CD3.

Brama na limfocytach T gamma-delta, zidentyfikowanych jako komórki o wysokiej zawartości CD3. Podziel limfocyty T gamma-delta na CD8-dodatnie i CD8-ujemne. Brama na komórkach NK, zidentyfikowana jako populacja pomiędzy komórkami CD3-dodatnimi i CD3-ujemnymi. Podziel komórki NK na CD8-dodatnie i CD8-ujemne bramki na komórkach B, zidentyfikowanych jako populacja CD3-ujemna, CD19-dodatnia w prawym dolnym rogu wykresu kropkowego.

Wybierz bramkę monocytów i utwórz wykres kropkowy z jednym z dwóch fluorochromów używanych w tym protokole na każdej osi. Brama w populacji CD3-ujemnej, CD14-dodatniej.