Wykorzystanie sond napięcia opartych na DNA do oceny sił receptorowych wywieranych przez komórki odpornościowe

Zacznij od funkcjonalizowanego szklanego szkiełka nakrywkowego z nanocząstkami złota zakotwiczonymi w glikolu polietylenowym.

Dodaj sondy napinające spinkę do włosów DNA zawierające spinkę do włosów DNA zhybrydyzowaną z dwoma oligonukleotydami w przeciwległych ramionach.

Nić ligandowa zawiera fluorofor i biotynę, podczas gdy nić kotwiczna zawiera wygaszacz i grupę tiolową. W tej konfiguracji wygaszacz hamuje fluorescencję.

Sondy DNA wiążą się z nanocząstkami złota, zakotwiczając się w szklanym szkiełku nakrywkowym.

Wprowadź streptawidynę, wchodząc w interakcję z cząsteczkami biotyny nici liganda.

Dodaj biotynylowane ligandy, które wiążą się z wstępnie związanymi cząsteczkami streptawidyny.

Na szkiełko nakrywkowe nakładają się limfocyty T CD8-dodatnie; ich receptory oddziałują z unieruchomionymi ligandami, tworząc miejsce interakcji receptor-ligand.

Ta interakcja generuje siłę, która rozwija strukturę spinki do włosów DNA, oddzielając fluorofor od wygaszacza i sprzyjając emisji fluorescencji.

Wprowadź niefluorescencyjne nici blokujące, które oddziałują z rozłożonymi segmentami sondy, aby zachować sygnał fluorescencyjny.

Określ ilościowo fluorescencję, aby ocenić siły receptorów wywierane przez komórki odpornościowe.

Na początek umieść 25-milimetrowe szkiełka nakrywkowe na stojaku z politetrafluoroetylenu w 50-mililitrowej zlewce i trzykrotnie opłucz szkiełka nakrywkowe, zanurzając je w wodzie. Wymieszać równe objętości etanolu i wody i dodać 40 mililitrów tego roztworu do zlewki zawierającej stojak i szkiełka nakrywkowe. Następnie uszczelnij zlewkę za pomocą taśmy parafilmowej.

Wyczyść szkiełka nakrywkowe przez sonikację zlewki przez 15 minut w myjce ultradźwiękowej, a po sonikacji wyrzuć płyn. Następnie przepłukać zlewkę zawierającą stojak i szkiełka nakrywkowe wodą co najmniej sześć razy, aby usunąć resztki rozpuszczalnika organicznego. Aby przygotować świeży roztwór piranii, dodaj 30 mililitrów kwasu siarkowego do 50-mililitrowej zlewki i powoli dodawaj 10 mililitrów nadtlenku wodoru. Delikatnie wymieszaj roztwór piranii za pomocą końcówki szklanej pipety.

Aby rozpocząć wytrawianie, należy przenieść stojak z szkiełkami nakrywkowymi do zlewki zawierającej roztwór piranii i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu oczyszczenia i hydroksylacji szkiełek nakrywkowych. Następnie przenieś stojak za pomocą pęsety stalowej lub politetrafluoroetylenowej do czystej 50-mililitrowej zlewki i spłucz wodą sześć razy. Aby całkowicie usunąć wodę, zanurz stojak z szkiełkami nakrywkowymi w 50-mililitrowej zlewce z 40 mililitrami etanolu, a następnie wyrzuć etanol.

Następnie zanurz stojak w 40 mililitrach etanolu zawierającego 3% aminopropylotrietoksysilanu na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby zainicjować reakcję z grupą hydroksylową na szkiełkach nakrywkowych. Spłucz powierzchnię szkiełka nakrywkowego sześć razy, zanurzając je w 40 mililitrach etanolu i wysusz w piekarniku w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Przykryj wewnętrzne dno szalki Petriego taśmą parafilmową, aby zapobiec przesuwaniu się szkiełek nakrywkowych wewnątrz szalki Petriego. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe pokryte aminami stroną, która ma być funkcjonalizowana, z sondami napinającymi DNA skierowanymi do góry. Przykryj szkiełka nakrywkowe w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości.

Aby zmodyfikować grupy aminowe na szkiełkach nakrywkowych, dodaj kwas liponowy-PEG-NHS i mPEG-NHS i inkubuj szalkę Petriego w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Pod koniec inkubacji spłucz powierzchnię trzykrotnie wodą. Następnie dodać 100 mikrolitrów 0,1-molowego wodorowęglanu sodu zawierającego 1 miligram na mililitr octanu sulfo-NHS do zestawu szkiełek nakrywkowych typu sandwich i inkubować przez 30 minut, aby nastąpiła pasywacja.

Dodaj 0,5 mililitra nanocząsteczek złota do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji spłucz szkiełka nakrywkowe wodą trzy razy. Po dodaniu 2 nici wygaszacza czarnej do wyżarzonej sondy naprężającej DNA w stosunku 10 do 1, dodaj 100 mikrolitrów mieszaniny na dwa szkiełka nakrywkowe, aby przygotować kanapkę.

Ostrożnie umieść mokrą kulkę tkanki laboratoryjnej na szalce Petriego z dala od szkiełek nakrywkowych i uszczelnij naczynie taśmą parafilmową, aby zapobiec wysychaniu roztworu. Następnie przykryj naczynie folią i inkubuj przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia zmontuj komorę obrazowania, uważając, aby nie dopuścić do pękania powierzchni podczas dokręcania komory. Następnie dodaj 0,5 do 1 mililitra zbilansowanego roztworu soli Hanka do komory obrazowania.

Użyj kanału Cy3B z obiektywem 100x, aby uchwycić sygnały fluorescencyjne komórek umieszczonych na sondach napinających spinkę do włosów DNA, gdy zaczną się rozprzestrzeniać. Po przygotowaniu 100 mikromolowych niefluorescencyjnych nici blokujących, w żądanym punkcie czasowym, dodaj go do komórek w końcowym stężeniu 1 mikromola w komorze obrazowania w celu przechowywania sygnału napięcia i wymieszaj go z komórkami przez pipetowanie.

Po około 10 minutach blokowania uzyskaj filmy poklatkowe lub obrazy końcowe w epifluorescencji zarówno do jakościowego mapowania napięcia, jak i analizy ilościowej.