JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 2:22 min • July 8th, 2025
Zacznij od szklanego naczynia do obrazowania zawierającego zawiesinę ludzkich neutrofili - lub komórek odpornościowych i wizualizuj je w systemie obrazowania fluorescencyjnego.
Wprowadź genetycznie zmodyfikowane fluorescencyjne konidia reporterowe Aspergillus — lub zarodniki grzybów i rób obrazy w regularnych odstępach czasu do 6 godzin.
Zarodniki grzybów wyrażają białka czerwonej fluorescencji i są zewnętrznie znakowane niedegradowalnymi purpurowymi fluoroforami - pomagając odróżnić martwe komórki od żywych.
Podczas inkubacji neutrofile oddziałują z cząsteczkami związanymi z patogenami na konidiach poprzez receptory rozpoznawania wzorców, ułatwiając ich pochłanianie w fagosomie.
Później fagosom łączy się z lizosomem zawierającym enzym, tworząc fagolizosom.
Wewnątrz fagolizosomu reaktywne formy tlenu i enzymy rozkładają konidia.
Podczas obrazowania żywych komórek, w początkowym punkcie czasowym, intensywna czerwona i purpurowa fluorescencja w fagosomie neutrofili wskazuje na obecność żywych konidiów.
Z biegiem czasu spadek czerwonej fluorescencji z zachowaniem fluorescencji magenty wskazuje na degradację konidiów, potwierdzając działanie przeciwgrzybicze neutrofili.
Aby uwidocznić DsRed i AlexaFlour 633 podczas mikroskopii, podgrzej grzałkę mikroskopu i włącz mikroskop oraz komputer. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 3 razy 10 do 6 na mililitr zawiesiny konidialnej FLARE do odpowiednich dołków naczynia do obrazowania. Zapisz czas dodawania konidiów FLARE.
Zamontuj czaszę obrazowania na stoliku mikroskopu. Następnie w ustawieniach akwizycji ustaw moc lasera na 10%, a czas ekspozycji na jedną sekundę i dostosuj czułość kamery, aby uzyskać wyraźny, ale nie prześwietlony obraz DsRed i AF 633, a następnie ustaw listę punktów etapu. Zainicjuj obrazowanie, gdy wszystkie punkty są ostre, kanały fluorescencyjne są zoptymalizowane, a czas i czas trwania cyklu są ustawione.