Test odroczonego hamowania wzrostu w celu oceny wpływu związków przeciwdrobnoustrojowych pochodzenia bakteryjnego
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:37 min • July 8th, 2025
Zacznij od płytki agarowej zawierającej składniki odżywcze i umieść na środku kroplę nocnej kultury bakterii pierwotnych wytwarzających inhibitory.
Pozostaw kulturę do wyschnięcia, zapewniając minimalne rozprzestrzenianie się bakterii, i inkubuj.
Poszczególne bakterie tworzą odrębne kolonie i wydzielają związki przeciwdrobnoustrojowe – cząsteczki inhibitorów, które dyfundują przez agar na pewną odległość.
Rozpyl rozcieńczoną kulturę konkurencyjnego szczepu bakteryjnego równomiernie na powierzchnię agaru, która zawiera kolonie bakterii pierwotnych.
Podczas inkubacji związki przeciwdrobnoustrojowe wchodzą w interakcje z konkurencyjnymi bakteriami i zakłócają ich podstawowe procesy komórkowe.
Powoduje to śmierć konkurencyjnych bakterii w tym konkretnym obszarze, powodując znaczny spadek wzrostu bakterii.
Na obszarze, na którym nie ma związków przeciwdrobnoustrojowych, konkurencyjne bakterie wykorzystują składniki odżywcze i tworzą odrębne kolonie.
Tworzy to zróżnicowany wzorzec wzrostu z wyraźną strefą hamowania. Określ średnicę tej strefy i przejrzystość strefy, aby ocenić wpływ związków przeciwdrobnoustrojowych pochodzenia bakteryjnego.
Aby przygotować kultury bakteryjne na noc, należy umieścić szczepy konkurencyjne i inhibitorowe na sterylnej płytce agarowej BHI i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza tlenowo przez około 18 godzin. W uniwersalnej butelce o pojemności 28 mililitrów zaszczepij 10 mililitrów sterylnego bulionu BHI pojedynczą kolonią wymaganego konkurencyjnego szczepu bakteryjnego.
Inkubuj kulturę w uniwersalnej wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 250 obr./min przez noc. Następnego dnia upewnij się, że płytki agarowe są całkowicie suche i nie ma kondensacji na pokrywce, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się inokulacji na płytce. Odpipetować 25 mikrolitrów nocnej kultury na środek płytek agarowych, unikając całkowitego wciśnięcia tłoka pipety, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, które rozpylają kulturę na agare.
Pozostaw kulturę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się kultury. Następnie inkubuj płytki agarowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza tlenowo przez noc. Po wyhodowaniu kultury przez noc podczas pracy pod szafką bezpieczeństwa poziomu 2 wyłożoną papierem chłonnym, użyj bulionu BHI, aby rozcieńczyć kulturę dziesięciokrotnie, aby uzyskać około 4 razy 10 do szóstej CFU na mililitr. Następnie wlej rozcieńczoną kulturę do sterylnej plastikowej butelki na waporyzator perfum.
Aby przeprowadzić test odroczonego zahamowania wzrostu, należy spryskać kulturę przez każdą z butelek parownika, aby upewnić się, że kultura została załadowana do mechanizmu rozpylania przed rozpyleniem na agar. Z odległości około 15 centymetrów nad agarem spryskaj około 250 mikrolitrów rozcieńczonej kultury na całej powierzchni agaru. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza tlenowo przez noc.
Aby zinterpretować odroczone zahamowanie wzrostu, zmierz strefę zahamowania wzrostu rozpylanego szczepu konkurencyjnego w milimetrach, odejmując średnicę centralnego miejsca producenta inhibitora. Na koniec zapisz wynik klarowności dla stref inhibicji zgodnie z protokołem tekstowym.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje działanie przeciwdrobnowe pierwotnych bakterii produkujących inhibitory na konkurencyjne szczepy bakteryjne przy użyciu testu odroczonego hamowania wzrostu. Poprzez pomiar stref zahamowania badacze mogą ocenić skuteczność związków przeciwdrobnych wydzielanych przez bakterie pierwotne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Badania nad środkami przeciwdrobnoustrojowymi
- Testy inhibicji
Wstęp
- Bakterie produkujące inhibitory mogą wydzielać związki przeciwdrobnoustrojowe.
- Związki te mogą hamować wzrost konkurencyjnych szczepów bakteryjnych.
- Zrozumienie tych oddziaływań może pomóc w opracowywaniu antybiotyków.
- Testy odroczonego hamowania wzrostu są standardową metodą oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej.
Cel badania
- Ocena działania przeciwdrobnoustrojowego bakterii pierwotnych wobec szczepów konkurencyjnych.
- Pomiar stref zahamowania wzrostu wywołanych przez związki przeciwdrobnoustrojowe.
- Ocena przejrzystości i średnicy stref zahamowania jako wskaźników skuteczności.
Zastosowane Metody
- Przygotowanie płytek z agarem z pierwotnymi kulturami bakterii.
- Nanoszenie konkurencyjnych szczepów bakteryjnych na powierzchnię agaru.
- Inkubacja płytek w celu umożliwienia wzrostu i interakcji.
- Pomiar stref zahamowania w celu określenia skuteczności przeciwdrobnoustrojowej.
Główne wyniki
- Wokół głównych kolonii bakteryjnych zaobserwowano wyraźne strefy zahamowania wzrostu.
- Bakterie konkurencyjne wykazały ograniczony wzrost w obszarach zawierających związki przeciwdrobnoustrojowe.
- Średnica stref zahamowania różniła się w zależności od użytych głównych bakterii.
- Wyniki oceny klarowności wskazały na skuteczność związków przeciwdrobnoustrojowych.
Wnioski
- Badanie pomyślnie wykazało właściwości przeciwdrobnoustrojowe bakterii pierwotnych.
- Testy hamowania wzrostu z odroczonym startem są skuteczne w ocenie interakcji bakteryjnych.
- Wyniki mogą przyczynić się do zrozumienia konkurencji bakteryjnej oraz opracowywania antybiotyków.
Często Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Test opóźnionej inhibicji wzrostu stanowi solidną platformę do ilościowego określania wpływu pochodzących z bakterii związków przeciwdrobnoustrojowych na szczepy konkurencyjne, co wspiera wczesne etapy odkrywania nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Dzięki możliwości precyzyjnego pomiaru stref inhibicji oraz ich klarowności, test ten dostarcza informacji niezbędnych do walidacji celów i ograniczania ryzyka mechanistycznego w procesach badawczo-rozwojowych nad substancjami przeciwdrobnoustrojowymi. Jego powtarzalne wyniki ułatwiają selekcję portfela oraz priorytetyzację związków kandydackich do dalszego rozwoju.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie badanie skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych przeciwko bakteriom konkurencyjnym.
- Wspiera funkcjonalną walidację szczepów produkujących inhibitory jako źródeł nowych środków przeciwdrobnoustrojowych.
- Dostarcza ilościowych danych do ograniczania ryzyka mechanistycznego i potwierdzania pewności celu.
- Ułatwia wczesne podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w procesie identyfikacji wiodących związków przeciwdrobnoustrojowych.
Przesiewanie i rozwój testów
- Ustanawia standaryzowany, powtarzalny test do oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej.
- Umożliwia generowanie ilościowych pomiarów stref zahamowania do przesiewu porównawczego.
- Zapewnia skalowalność i możliwość ponownego wykorzystania platformy dla różnych szczepów bakteryjnych.
- Umożliwia wiarygodną ocenę siły działania związku w dalszych etapach analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgadza się ze strategiami biomarkerów translacyjnych poprzez ilościowe określanie funkcjonalnych efektów przeciwdrobnoustrojowych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po przedkliniczną walidację kandydatów na leki przeciwdrobnoustrojowe.
- Wspiera decyzje dotyczące postępów prac, skorygowane o ryzyko, w oparciu o powtarzalne wyniki biologiczne.
- Oferuje predykcyjną redukcję ryzyka przy wyborze kandydatów w portfolio środków przeciwdrobnoustrojowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy test wpisuje się w proces od odkrycia do fazy przedklinicznej, stanowiąc pomost między wczesną walidacją celu, identyfikacją związku wiodącego a oceną przedkliniczną związków przeciwdrobnoustrojowych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie aktywności przeciwdrobnoustrojowej w celu wyjaśnienia mechanizmów biologicznych i walidacji celów.
- Przesiewanie: Dostarczanie zestandaryzowanych, powtarzalnych danych o strefach zahamowania do porównywania związków.
- Analityka: Zapewnianie mierzalnych wyników — średnicy i przejrzystości strefy — dla rzetelnej analizy statystycznej.
- Badania translacyjne: Wspieranie ciągłości poprzez powiązanie skuteczności in vitro z wyborem kandydata do badań przedklinicznych.
- Ponowne zastosowanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonowanie jako wielorazowa platforma testowa, którą można dostosować do różnych układów bakteryjnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w procesie odkrywania leków przeciwdrobnoustrojowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność analiz w ramach zespołów badawczo-rozwojowych (R&D).
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową we wczesnych etapach rozwoju produktów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację i rozwój kandydatów na leki przeciwdrobnoustrojowe w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli mikrobiologicznej oraz interpretacji ilościowych wyników testów.
- Wymaga dostępu do sterylnych szalek z agarem, inkubatorów i precyzyjnych narzędzi pomiarowych.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności pomiarów stref oraz oceny przejrzystości.
- Metoda jest możliwa do zastosowania dla różnych szczepów bakteryjnych, jednak może wymagać optymalizacji protokołu dla poszczególnych gatunków.
- Niezawodność testu zależy od dokładności technik rozcieńczania i wysiewania na podłoże.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Zastosowanie techniki miękkiego nakładki agarowej do badań przesiewowych pod kątem związków hamujących wytwarzanych przez bakterie
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L.
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Badania przesiewowe cyklicznych modulatorów di-GMP z wykorzystaniem bakterii wyrażających fluorescencyjne białko reporterowe
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Test resazuryny agarowej z węglem drzewnym w celu oceny aktywności badanego związku przeciwko prątkom
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Test mikrorozcieńczenia bulionu in vitro do badań przesiewowych związków przeciwgrzybiczych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Test do pomiaru akumulacji fluorescencyjnej sondy antybiotykowej w komórkach bakteryjnych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Opracowanie wysokowydajnego zestawu do badań przesiewowych małych cząsteczek, które modulują sygnalizację c-di-GMP u Pseudomonas aeruginosa
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Test odroczonego hamowania wzrostu w celu ilościowego określenia wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych pochodzenia bakteryjnego na konkurencję
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026