Test komórkowy do identyfikacji czynników oddziałujących z CXCR4

Weź pokrytą żelatyną płytkę wielodołkową zawierającą przylegające ludzkie komórki raka mózgu wykazujące ekspresję CXCR4.

Zastąp podłoże barwnikiem wrażliwym na wapń. Esterazy wewnątrzkomórkowe rozszczepiają barwnik na produkt nieprzepuszczalny dla błony, który wiąże się z jonami wapnia, wykazując zwiększoną fluorescencję.

Usuń barwnik, umyj i dodaj bufor.

Umieścić płytkę w czytniku mikropłytek fluorescencyjnych ze związkiem oddziałującym z CXCR4 i płytkami zawierającymi chemokinę CXCL12.

Korzystając z ustawionych parametrów automatycznych, wstrzyknij rosnące stężenia związków do dołków testowych, a następnie określone stężenie CXCL12.

W studzienkach kontrolnych bez tego związku CXCL12 wiąże się z CXCR4.

To wiązanie aktywuje kaskadę sygnalizacyjną, uwalniając jony wapnia do cytoplazmy, gdzie wiążą barwnik, intensyfikując fluorescencję.

Jednak w studzienkach testowych oddziałujące związki hamują wiązanie CXCL12 z CXCR4, wpływając na mobilizację wapnia i powodując zależny od dawki spadek fluorescencji, co potwierdza, że są one antagonistami CXCR4.

W dniu pasażowania komórek pokryj każdą studzienkę 96-dołkowej płytki z czarnego polistyrenu z przezroczystym dnem 100 mikrolitrami 0,1% ro