Test komórkowy do identyfikacji czynników oddziałujących z CXCR4

Weź pokrytą żelatyną płytkę wielodołkową zawierającą przylegające ludzkie komórki raka mózgu wykazujące ekspresję CXCR4.

Zastąp podłoże barwnikiem wrażliwym na wapń. Esterazy wewnątrzkomórkowe rozszczepiają barwnik na produkt nieprzepuszczalny dla błony, który wiąże się z jonami wapnia, wykazując zwiększoną fluorescencję.

Usuń barwnik, umyj i dodaj bufor.

Umieścić płytkę w czytniku mikropłytek fluorescencyjnych ze związkiem oddziałującym z CXCR4 i płytkami zawierającymi chemokinę CXCL12.

Korzystając z ustawionych parametrów automatycznych, wstrzyknij rosnące stężenia związków do dołków testowych, a następnie określone stężenie CXCL12.

W studzienkach kontrolnych bez tego związku CXCL12 wiąże się z CXCR4.

To wiązanie aktywuje kaskadę sygnalizacyjną, uwalniając jony wapnia do cytoplazmy, gdzie wiążą barwnik, intensyfikując fluorescencję.

Jednak w studzienkach testowych oddziałujące związki hamują wiązanie CXCL12 z CXCR4, wpływając na mobilizację wapnia i powodując zależny od dawki spadek fluorescencji, co potwierdza, że są one antagonistami CXCR4.

W dniu pasażowania komórek pokryj każdą studzienkę 96-dołkowej płytki z czarnego polistyrenu z przezroczystym dnem 100 mikrolitrami 0,1% roztworu żelatyny i inkubuj płytki przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Podczas krzepnięcia żelatyny użyj roztworu trypsyny-EDTA, aby podnieść interesujące komórki z dna kolby hodowlanej, ponownie zawieszając komórki w świeżej pożywce wzrostowej w 50-mililitrowej stożkowej probówce po ich odłączeniu.

Po zliczeniu zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w świeżej pożywce wzrostowej do stężenia 1 x 10⁵ żywych komórek na mililitr. Gdy płytki będą gotowe, wyrzuć nadmiar roztworu żelatyny i wysusz płytki na tkance laboratoryjnej. Następnie umyj studzienki 200 mikrolitrami PBS i zastąp płukanie 200 mikrolitrami komórek na studzienkę, na nocną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnego ranka postukaj w płytkę, aby wyrzucić pożywkę wzrostową z dołków i osusz płytkę do góry nogami na ręczniku papierowym. Następnie oznacz komórki w każdym dołku 100 mikrolitrami roztworu barwnika na studzienkę i inkubuj płytkę przez 45 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji komórek dodaj 75 mikrolitrów CXCL12 na studzienkę do płytki chemokinowej i 50 mikrolitrów interesującego związku do każdej studzienki płytki złożonej.

Następnie włącz chłodnicę czytnika płytek fluorescencyjnych, a następnie sam czytnik płytek. Po odczekaniu kilku minut na zainicjowanie systemu otwórz oprogramowanie czytnika tabliczek. Aby skonfigurować protokół testu, na karcie Ustawienia wybierz Tryb odczytu oraz odpowiednią długość fali wzbudzenia i emisji dla barwnika obciążeniowego.

Wybierz zakładkę "Mieszaj z płynem transferowym", aby automatycznie mieszać związki w płytce mieszanej. W zakładce "Płyn transferowy" ustaw 20 mikrolitrów każdego dołka z płytki złożonej, która ma zostać przeniesiona na płytkę pomiarową, i umieść końcówki pipet na głębokości 20 mikrolitrów poniżej powierzchni cieczy. Ustaw prędkość zasysania na 50 mikrolitrów na sekundę, a prędkość dozowania na 25 mikrolitrów na sekundę i kliknij "Czytaj z płynem transferowym".

W pierwszym interwale wybierz 60 odczytów z interwałem odczytu wynoszącym jedną sekundę z 10 odczytami do zarejestrowania przed dozowaniem związków do płytki pomiarowej i 50 odczytów do zakończenia po. Ustaw drugi interwał z czasem interwału odczytu wynoszącym 30 sekund i 18 odczytów. Wybierz trzy mycia końcówkami do protokołu, ustawiając każdy krok prania tak, aby zawierał odpowiedni płyn do prania, jeden cykl prania, dużą prędkość pompy i pięć ruchów na pranie.

Użyj funkcji "Pause Pipettor", aby włączyć 300-sekundową przerwę w pipetorze, a następnie użyj ustawienia "Mix with Transfer Fluid", aby umożliwić automatyczne mieszanie roztworu CXCL12 w płytce chemokinowej. W kolejnej zakładce "Płyn transferowy" ustaw 25 mikrolitrów z każdej studzienki płytki chemokiny, która ma zostać przeniesiona na płytkę pomiarową i umieść końcówki 20 mikrolitrów poniżej powierzchni cieczy. Ustaw prędkość zasysania na 50 mikrolitrów na sekundę, a prędkość dozowania na 25 mikrolitrów na sekundę.

Użyj przycisku "Odczyt z płynem transferowym", aby ustawić pierwszy interwał tak, aby zawierał 145 odczytów z interwałem odczytu wynoszącym jedną sekundę. Ustaw drugi interwał na czas interwału odczytu wynoszący sześć sekund i 20 odczytów. Wybierz trzy kolejne cykle końcówki prania, a następnie kliknij "Set Stage Temperature" i ustaw temperaturę urządzenia na 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji z użyciem barwnika należy wyrzucić bufor z płytki pomiarowej i wysuszyć płytkę na tkance laboratoryjnej. Przemyć komórki 150 mikrolitrami buforu do oznaczania na studzienkę, zastępując bufor 80 mikrolitrami buforu testowego po dwóch minutach. Umieść płytkę pomiarową w pozycji do odczytu, płytkę złożoną w pozycji źródła 2, płytkę chemokinową w pozycji źródła 3, a pudełko czarnych końcówek w pozycji źródła 1.

Zamknij urządzenie i kliknij "Test sygnału protokołu" , aby określić względne jednostki światła tła i warianty fluorescencji na płycie. Wybierz Test "Sygnał" w wyskakującym okienku. Jeśli uzyskane zostaną wartości tła od 8 000 do 10 000 względnych jednostek światła, wybierz "Aktualizuj" i kliknij "Zapisz", aby zapisać główny protokół.