Pomiar in vitro aktywności enzymów α-galaktozydazy A i kwaśnej α-glukozydazy

α-galaktozydaza A i kwaśna α-glukozydaza są enzymami lizosomalnymi kluczowymi dla metabolizmu komórkowego.

α-galaktozydaza A rozkłada substraty, takie jak glikolipidy, podczas gdy kwaśna α-glukozydaza hydrolizuje glikogen.

Aby zmierzyć ich aktywność enzymatyczną in vitro, należy pobrać wielodołkowe studzienki płytkowe z próbkami zawierającymi znane stężenia odpowiednio α-galaktozydazy A i kwaśnej α-glukozydazy.

Dodać wymaganą objętość kwaśnych roztworów syntetycznych substratów 4-metylolumbelliferylu do studzienek, specyficznych substratów fluorogenicznych zaprojektowanych do naśladowania naturalnych substratów dla tych enzymów.

Wysiaduj w ciemności.

α-galaktozydaza A i enzymy kwaśnej α-glukozydazy rozszczepiają swoje odpowiednie substraty, uwalniając produkt fluorescencyjny, 4-metylolumbelliferon.

Dodaj bufor alkaliczny, aby zakończyć reakcję enzymatyczną.

Za pomocą czytnika fluorescencji mikropłytek zmierz intensywność fluorescencji 4-metylolumbelliferonu w studzienkach, wskazując jego stężenie, aby określić odpowiednio aktywność enzymu α-galaktozydazy A i kwaśnej α-glukozydazy

.

Rozcieńczyć obliczoną ilość każdej próbki i odpipetować ją do świeżych 1,5-mililitrowych probówek reakcyjnych, aby otrzymać 0,05 mikrograma alfa-galaktozydazy A lub 0,5 mikrograma kwaśnej alfa-glukozydazy na mikrolitr roztworu. Ponownie wirować próbki przez 5 sekund, a następnie odpipetować 10 mikrolitrów tego rozcieńczenia i powielić na 96-dołkowej płytce.

Rozpocznij reakcje, dodając 20 mikrolitrów odpowiedniego roztworu substratu. W przypadku alfa-galaktozydazy A dodać 2 milimolowe 4-metylolumbelliferyl-alfa-D-galaktopyranozyd lub 4-MU-Gal w 0,06-molowym buforze cytrynianu fosforanu, pH 4,7. W przypadku kwaśnej alfa-glukozydazy dodać 2 milimolowe 4-metylolumbelliferyl-alfa-D-glukopiranozyd lub 4-MU-Glu w 0,025 molowym octanie sodu, pH 4,0.

Inkubuj reakcje enzymatyczne przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 300 obr./min na wytrząsarce orbitalnej. Następnie zakończ reakcję, dodając 200 mikrolitrów 1,0 molowego buforu wodorotlenku sodu o pH 10,5 dostosowanym do glicyny. Przygotować wzorcową krzywą 4-MU z 0,01 miligrama na mililitr materiału podstawowego zgodnie z protokołem tekstowym i odpipetować 10 mikrolitrów roztworów w dwóch egzemplarzach na płytkę 96-dołkową.

Dodać 200 mikrolitrów 1,0-molowego buforu wodorotlenku sodu glicyny do każdej studzienki w celu dostosowania objętości i pH. Na koniec należy zmierzyć aktywność enzymu w czytniku fluorescencyjnym wyposażonym w odpowiedni zestaw filtrów, a następnie przeanalizować dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania do czytnika fluorescencji.