Pomiar in vitro aktywności enzymów α-galaktozydazy A i kwaśnej α-glukozydazy

α-galaktozydaza A i kwaśna α-glukozydaza są enzymami lizosomalnymi kluczowymi dla metabolizmu komórkowego.

α-galaktozydaza A rozkłada substraty, takie jak glikolipidy, podczas gdy kwaśna α-glukozydaza hydrolizuje glikogen.

Aby zmierzyć ich aktywność enzymatyczną in vitro, należy pobrać wielodołkowe studzienki płytkowe z próbkami zawierającymi znane stężenia odpowiednio α-galaktozydazy A i kwaśnej α-glukozydazy.

Dodać wymaganą objętość kwaśnych roztworów syntetycznych substratów 4-metylolumbelliferylu do studzienek, specyficznych substratów fluorogenicznych zaprojektowanych do naśladowania naturalnych substratów dla tych enzymów.

Wysiaduj w ciemności.

α-galaktozydaza A i enzymy kwaśnej α-glukozydazy rozszczepiają swoje odpowiednie substraty, uwalniając produkt fluorescencyjny, 4-metylolumbelliferon.

Dodaj bufor alkaliczny, aby zakończyć reakcję enzymatyczną.

Za pomocą czytnika fluorescencji mikropłytek zmierz intensywność fluorescencji 4-metylolumbelliferonu w studzienkach, wskazując jego stężenie, aby określić odpowiednio aktywność enzymu α-galaktozydazy A i kwaśnej α-glukozydazy

.

Rozcieńczyć obliczoną ilość każdej próbki i odpipetować ją do świeżych 1,5-mililitrowych probówek reak