JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 2:38 min • July 8th, 2025
Weź komórki raka wątroby i inkubuj w niskiej temperaturze, aby upośledzać endocytozę.
Wprowadź rekombinowany wirus zapalenia wątroby typu C lub HCV, składający się ze zmodyfikowanego genomu RNA kodującego wydzielany reporter lucyferazy.
Lipoproteiny wirusa oddziałują z proteoglikanami na komórkach gospodarza, podczas gdy glikoproteiny otoczki wirusa wiążą się ze specyficznymi receptorami gospodarza.
W wybranych studzienkach dodać badany związek, który wiąże się z glikoproteinami wirusowymi.
Po inkubacji w temperaturze fizjologicznej związane wirusy są endocytozyzowane.
Odrzuć niezinternalizowane wirusy, dodaj pożywkę wzrostową i inkubuj.
W nieleczonych studzienkach glikoproteiny wspomagają fuzję otoczki wirusowej z endosomem, uwalniając nukleokapsyd, podczas gdy maskowanie związków upośledza fuzję w studzienkach poddanych obróbce.
Po uwolnieniu RNA ulega ekspresji białek wirusowych, w tym lucyferazy, która jest wydzielana zewnątrzkomórkowo.
Zbierz supernatant zawierający lucyferazy i dodaj bioluminescencyjne podłoże, które jest utleniane przez lucyferazy w celu wyemitowania światła.
Zmniejszona luminescencja w studzienkach poddanych działaniu środka w porównaniu z dołami nieleczonymi wskazuje na zahamowanie fuzji otoczki wirusowej z endosomem.
W celu sprawdzenia fuzji i wniknięcia wirusa należy wstępnie schłodzić płytkę hodowli komórkowej w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez godzinę po całonocnej inkubacji w celu przyłączenia komórek. Usuń istniejącą pożywkę z dołków i zainfekuj komórki 10 do drugiego FFU HCV na lodzie.
Inkubuj płytkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Delikatnie umyj komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami lodowatego PBS, aby usunąć nieprzylegającego wirusa. Następnie, na lodzie, potraktować komórki badanym związkiem rozpuszczonym w podłożu podstawowym lub pożywce podstawowej z 1% DMSO jako kontroli i inkubować szalkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Pozwala to na ocenę badanych związków przy wnikaniu wirusa, które następuje w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć niezinternalizowane wirusy 200 mikrolitrami buforu cytrynianowego lub PBS. Dodaj 100 mikrolitrów podłoża podstawowego na studzienkę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejne 72 godziny. Zebrać supernatant i przeprowadzić test lucyferazy Gaussa, jak pokazano wcześniej, w celu wykrycia uwolnionego reportera lucyferazy.