Kolorymetryczne wykrywanie biomarkera bakteryjnego za pomocą zmodyfikowanego papierka lakmusowego

Zacznij od DNAzymu rozszczepiającego RNA, katalitycznego DNA, które po związaniu się z określonym biomarkerem bakteryjnym ulega aktywacji.

DNAzym jest połączony z kulką magnetyczną pokrytą streptawidyną za pomocą biotyny na jej końcu 5'. Na końcu 3' jest związany z ureazą połączoną z oligonukleotydami, tworząc funkcjonalny koralik magnetyczny.

Do probówki zawierającej funkcjonalne kulki magnetyczne dodać lizatan E. coli.

Specyficzny biomarker E. coli z lizatu aktywuje DNAzyme, wywołując rozszczepienie wiązania RNA, powodując oderwanie koniugatu DNAzyme-ureaza.

Użyj podstawki magnetycznej, aby unieruchomić koraliki i usunąć sprzęg DNAzyme-ureaza związany z koralikami.

Przenieść uwolniony supernatant zawierający ureazę do innej probówki.

Dodaj barwnik wskaźnikowy pH — czerwień fenolową i roztwór mocznika.

Ureaza hydrolizuje mocznik do amoniaku i dwutlenku węgla.

Amoniak, słaba zasada, podnosi pH roztworu, powodując zmianę koloru, co wskazuje na obecność biomarkera E. coli.

Po przygotowaniu komórek E. coli zgodnie z protokołem tekstowym, należy wstępnie umyć 1,5-mililitrową probówkę do mikrofuge, dodając i wirując 100 mikrolitrów RB. Następnie wyrzuć bufor.

Dodaj 15 mikrolitrów zmontowanego EC1 do umytej probówki, a następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym i odessaj supernatant. Wyjmij rurkę ze stojaka, dodaj 100 mikrolitrów RB i ostrożnie ponownie zawieś kulki magnetyczne.

Po użyciu RB do dwukrotnego umycia kulek i usunięciu RB, dodaj 10 mikrolitrów próbki E. coli do probówki i delikatnie wymieszaj zawartość, stukając w probówkę. Następnie inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Po inkubacji dodaj 90 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody i umieść probówkę na stojaku magnetycznym. Po około trzech minutach separacji magnetycznej ostrożnie przenieś 85 mikrolitrów supernatantu do 0,5-mililitrowej probówki do mikrofiltrówki.

Bardzo ważne jest, aby ostrożnie pipetować roztwór, nie pobierając żadnych kulek magnetycznych. Te koraliki są naładowane ureazą i generują fałszywie dodatni sygnał.

Dodaj 15 mikrolitrów 0,04% czerwieni fenolowej i 100 mikrolitrów roztworu substratu. Następnie rób zdjęcia w określonych odstępach czasu, aby zarejestrować zmianę koloru.