Ilościowa mikroskopia poklatkowa do oceny rozsiewu bakterii zależnego od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej

Pobrać płytkę wielodołkową z przylegającymi monowarstwami ludzkich komórek śródbłonka na hydrożelach poliakrylamidowych pokrytych kolagenem o różnej sztywności.

Komórki na sztywniejszych hydrożelach ulegają znacznej reorganizacji cytoszkieletu, zwiększając napięcie wewnątrzkomórkowe w porównaniu z bardziej miękkimi hydrożelami.

Umyj komórki pożywką i dodaj zmodyfikowane Listeria monocytogenes — wykazujące ekspresję białka fluorescencyjnego pod promotorem białka indukującego składanie aktyny (ActA).

Wirówka ułatwiająca kontakt komórki z bakteriami. Inkubować za pośrednictwem endocytozy bakteryjnej.

Umyć mediami. Traktuj gentamycyną, aby wyeliminować niezinternalizowane bakterie. Inkubować.

Zinternalizowane bakterie uwalniają toksyny tworzące pory, zaburzając błony fagosomalne. Bakterie cytozolowe zwiększają ekspresję ActA i fluorescencji białek, znakując bakterie wewnątrzkomórkowe.

Białka ActA indukują polimeryzację aktyny, tworząc warkocz komety aktyny, który popycha bakterie do przodu, powodując internalizację przez sąsiednie komórki i sprzyjając rozprzestrzenianiu się.

Po inkubacji użyj pożywki zawierającej barwnik do barwienia jąder komórkowych. Zastąp pożywkę pożywką zawierającą gentamycynę.

Wykonaj mikroskopię poklatkową.

Bardziej miękkie hydrożele sprzyjają szybkiemu rozprzestrzenianiu się bakterii międzykomórkowych w porównaniu ze sztywniejszymi hydrożelami o zwiększonym napięciu wewnątrzkomórkowym, co sugeruje rozprzestrzenianie się bakterii zależne od sztywności macierzy.

Po przygotowaniu nocnej hodowli L. monocytogenes zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś 1 mililitr kultury do probówki mikrowirówkowej i odwiruj ją z prędkością 2000 g i temperaturze pokojowej przez 4 minuty. Po dwukrotnym umyciu osadu PBS do hodowli tkankowej, należy użyć 1 mililitra PBS do ponownego zawieszenia osadu.

Przygotuj mieszankę infekcyjną, łącząc 10 lub 50 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej z 1 mililitrem pełnej pożywki MCDB-131 dla wielokrotności infekcji lub MOI, około 50 bakterii na komórkę gospodarza lub 10 bakterii na komórkę gospodarza. Usunąć pożywkę z dołków 24-dołkowych płytek, uważając, aby nie uszkodzić hydrożeli ani komórek.

Użyj 1 mililitra pełnej pożywki MCDB-131, aby raz umyć komórki, a następnie dodaj 1 mililitr bakterii do każdej studzienki. Umieść pokrywkę na talerzach i owiń je folią spożywczą z polietylenu, aby uniknąć wycieku. Odwirować płytki o masie 2 000 x g przez 10 minut, aby zsynchronizować inwazję. Następnie inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Za pomocą pełnej pożywki MCDB-131 umyj próbki 4 razy i włóż je z powrotem do inkubatora do hodowli tkankowych. Po dodatkowych 30 minutach zastąp pożywkę pełną pożywką MCDB-131 uzupełnioną o 20 mikrogramów na mililitr gentamycyny.

Po wysianiu komórek HMEC-1 na hydrożelach PA i potraktowaniu gentamycyną zgodnie z protokołem tekstowym, inkubować płytkę przez pięć godzin, aby umożliwić promotorowi ActA włączenie się i sterowanie ekspresją otwartej ramki odczytu mTagRFP.

Cztery godziny po zakażeniu wymieszaj 1 mikrolitr 1 mg / ml barwnika Hoechst z 1 mililitrem pełnego podłoża L15 i dodaj go do każdego dołka, aby zabarwić jądra. Po inkubacji komórek przez 10 minut, zastąp pożywkę 1 mililitrem pełnej pożywki L15 uzupełnionej 20 mikrogramami na mililitr gentamycyny.

Obrazuj wiele pozycji co 5 minut za pomocą funkcji autofokusa, aby monitorować, w jaki sposób bakterie LM rozprzestrzeniają się przez monowarstwy HMEC-1 osadzone na hydrożelach o różnej sztywności.