JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 2:48 min • July 8th, 2025
Rozpocząć od próbki zawierającej wirusa uzyskanej z zakażonej rogówki świni leczonej lekiem przeciwwirusowym.
Przeprowadzić seryjne rozcieńczanie próbki, aby stworzyć sekwencję malejących stężeń wirusa.
Optymalne rozcieńczenie zapobiega zakażeniu pojedynczych komórek wieloma wirusami.
Wprowadzić rozcieńczone próbki do monowarstwy komórki gospodarza i inkubować.
Wirus przyłącza się do receptora komórki gospodarza, wnika do komórki i inicjuje jej replikację. Zainfekowana komórka ulega lizie, uwalniając wiriony.
Dodaj metylocelulozę, lepką substancję, która ogranicza wirusy do pobliskich komórek.
Następnie wirusy powodują śmierć komórek i tworzenie się płytki nazębnej w zakażonym regionie.
Dodaj metanol, aby naprawić komórki.
Użyj fioletu krystalicznego do barwienia żywych komórek.
Obserwuj blaszki jako przezroczyste strefy wskazujące na zainfekowane komórki i śmierć komórki, otoczone niezainfekowanymi komórkami zabarwionymi krystalicznym fioletem.
Na koniec policz liczbę blaszek w najwyższym rozcieńczeniu, aby określić ilościowo miano wirusa w roztworze wyjściowym w celu określenia skuteczności leku przeciwwirusowego.
Aby określić ilościowo ilość wirusa pobranego z każdej rogówki, należy przygotować jednokrotne rozcieńczenie wirusa log10 w pożywce bez surowicy w probówkach do mikrowirówek, aż do osiągnięcia rozcieńczenia 1 x 10-8.
Po zassaniu pożywki wzrostowej z każdej studzienki komórek, przenieś 1 mililitr każdego rozcieńczenia wirusa, zaczynając od 1 x 10-3 do posianych monowarstw komórek i umieść zakażone komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych na dwie godziny. Pod koniec inkubacji delikatnie przemyj każdą studzienkę 2 razy PBS przed dodaniem 2 mililitrów pożywki zawierającej metylocelulozę do każdej studzienki na 72-godzinną inkubację lub do momentu, gdy będzie można zaobserwować tworzenie się blaszek.
Po obserwacji płytki nazębnej powoli dodaj 1 mililitr metanolu do rogu każdej studzienki na 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji powoli zasysaj zawartość z każdej studzienki, nie naruszając monowarstwy komórki.
Następnie oznacz każdą studzienkę 1 mililitrem roztworu roboczego fioletu krystalicznego, uważając, że wszystkie komórki są pokryte na 30-minutową inkubację chronioną przed światłem. Pod koniec inkubacji wyrzucić roztwór i wysuszyć studzienki na arkuszu papieru chłonnego. Następnie policz liczbę blaszek w studzience o najwyższym rozcieńczeniu, aby 3 razy określić ilościowo całkowitą zawartość wirusa w roztworze wyjściowym.