Test do określenia inicjacji biofilmu wielodrobnoustrojowego na komórkach zakażonych wirusem

Pobrać płytkę wielodołkową zawierającą monowarstwy komórek ssaków.

Studnie testowe nasion z wirusem opryszczki pospolitej. W studzienkach kontrolnych brakuje wirusa.

Wirus przyłącza się do siarczanu heparanu na powierzchni komórki i jest internalizowany przez endocytozę.

Zakażenie wirusem wyzwala wydzielanie heparanazy, która rozszczepia siarczan heparanu i demaskuje określone receptory grzybowe.

Współinkubować komórki z rurkami rozrodczymi Staphylococcus aureus i Candida albicans.

W komórkach zakażonych wirusem niedobór siarczanu heparanu hamuje interakcje bakteryjne, jednocześnie promując interakcje z receptorami grzybów, zapobiegając kolokalizacji bakteryjnej i grzybiczej.

W komórkach kontrolnych bakterie oddziałują z siarczanem heparanu, podczas gdy grzyby wiążą się z dostępnymi receptorami.

Ta kolokalizacja mikrobiologiczna inicjuje przyleganie — pierwszy krok w tworzeniu biofilmu.

Po inkubacji usuń niezwiązane drobnoustroje. Nakładka z buforem do lizy, uwalniająca bakterie i grzyby do pożywki.

Rozprowadzić lizat komórkowy na płytkach zawierających pożywkę wzrostową. Inkubuj w celu utworzenia kolonii.

Zmniejszenie liczby kolonii bakteryjnych przy odpowiadającym mu wzroście kolonii grzybów wskazuje na indukowane przez wirusa hamowanie kolokalizacji bakteryjno-grzybiczej i inicjacji biofilmu.

Aby przeprowadzić test biofilmu wielomikrobiologicznego, wysiewaj 96-dołkowe płytki z 200 mikrolitrami 2 razy 10 do 5 komórek HeLa na mililitr. Kołysz talerzami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 45 minut, a następnie inkubuj w 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin. Użyj 1x optimum do prania monowarstw. Następnie wysiewaj pojedynczy szczep HSV. Testuj tylko jeden szczep na raz.

Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez trzy godziny. Używając 100 mikrolitrów PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza z magnezem i wapniem, umyj zainfekowane monowarstwy. Następnie użyj HBSS o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zastąpić PBS. Pozostaw 25 mikrolitrów HBSS w każdym dołku.

Następnie dodać zawiesiny robocze GT i/lub S. aureus i inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 30 minut. Po inkubacji odsysać po jednej kolumnie płytki na raz. Natychmiast napełnij studzienki za pomocą 300 mikrolitrów PBS magnezem i wapniem.

Po dwukrotnym powtórzeniu tego kroku płukania dodaj 200 mikrolitrów w rozcieńczeniu od 1 do 50 sterylizowanego filtrem buforu do lizy RIPA do każdej studzienki.

Podczas pracy z innymi szczepami bakterii lub grzybów należy upewnić się, że stężenie użytego RIPA jest wystarczające do lizy komórek, ale nadal dopuszczalne do badania żywotności drobnoustrojów.

Szybko roztruć lizat komórek HeLa i odpipetować 50 mikrolitrów na sole mannitolu i/lub pożywkę grzybobójczą. Następnie za pomocą szklanego pręta wygiętego pod kątem 90 stopni rozprowadź lizat na powierzchni płytki.

Po inkubacji płytek przez 18 godzin ręcznie policz liczbę kolonii na płytce. Kontrola polega na przyleganiu S. aureus i/lub C. albicans do komórek HeLa niezakażonych HSV.