JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 3:48 min. • July 8th, 2025
Weź płytkę do mikromiareczkowania i dodaj seryjne rozcieńczenia nowych peptydów przeciwdrobnoustrojowych lub AMP - związków testowych.
Wyznacz podzbiór studzienek jako kontrole wzrostu i dodaj sterylną wodę bez AMP.
Dodaj chorobotwórczego grzyba zawieszonego w pożywce wzrostowej do wybranych studzienek.
Dodać tylko pożywkę, pozbawioną grzyba, do podzbioru studzienek oznaczonych jako ślepe kontrole.
Uszczelnij płytkę i inkubuj w wilgotnych warunkach sprzyjających rozwojowi grzybów.
Po inkubacji obserwuj studzienki pod mikroskopem.
Regulatory wzrostu wydają się mętne z powodu wzrostu grzybów przy braku AMP. Zmętnienie we wszystkich rozcieńczeniach AMP wskazuje na jego nieskuteczność w walce z grzybem.
Puste kontrole, pozbawione narośli grzybów, wydają się przezroczyste. Porównaj studzienki testowe z ślepymi kontrolami, aby potwierdzić brak wzrostu, wskazując na aktywność przeciwgrzybiczą AMP.
Najniższe stężenie AMP, które hamuje wzrost grzybów, nazywa się minimalnym stężeniem hamującym lub MIC.
Test przeciwgrzybiczy przeprowadza się w trzech egzemplarzach na 96-dołkowych mikropłytkach polistyrenowych przy użyciu 2-krotnego seryjnego rozcieńczenia każdego peptydu i kontrolnego środka przeciwgrzybiczego oraz końcowej objętości 50 mikrolitrów na studzienkę.
Najważniejszym krokiem w protokole jest seryjne rozcieńczanie. Bądź więc bardzo ostrożny podczas kilku następnych kroków, aby uniknąć błędów, które zagrożą całej analizie.
Za pomocą pipety dodać 100 mikrolitrów peptydu przeciwgrzybiczego w stężeniu o podwójnej mocy najwyższego pożądanego stężenia końcowego w kolumnach od pierwszej do trzeciej w rzędzie A. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 mikrolitrów sterylnej wody do pozostałych studzienek w rzędach od B do H. Usunąć 50 mikrolitrów studzienek o najwyższym stężeniu, Przenieść do odpowiednich studzienek o następnym stężeniu i homogenizować przez kilkakrotne pipetowanie w górę i w dół.
Powtarzać seryjne rozcieńczanie, aż do osiągnięcia studzienek o najniższym stężeniu i wyrzucić 50 mikrolitrów z tych studzienek. Pozostawić kolumny 11 i 12 w wierszach A, B i C tylko z wodą na ślepe próby kontrolne lub ujemne kontrole wzrostu. Dodać 50 mikrolitrów inokulum o podwójnej mocy w pożywce RPMI1640 do każdej studzienki w kolumnach 1 do 3 i kolumnie 11.
Końcowe stężenie dla C. albicans wyniesie 2 000 komórek na mililitr, a końcowe stężenie dla C. neoformans wyniesie 10 000 komórek na mililitr. Przygotuj ujemne kontrole wzrostu, mieszając 50 mikrolitrów wody i 50 mikrolitrów dostosowanego inokulum bez środka przeciwgrzybiczego. Przygotować ślepe próby kontrolne, łącząc 50 mikrolitrów wody i 50 mikrolitrów pożywki bez komórek.
Załaduj elementy sterujące do odpowiednich studzienek. Obserwuj wszystkie studzienki za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego, a następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Po okresie inkubacji należy ponownie obserwować wszystkie studzienki, aby zweryfikować zmiany w morfologii, a także sprawdzić, czy nie ma oznak zanieczyszczenia.