JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 4:23 min • July 8th, 2025
Weź płytkę wielodołkową zawierającą sferoidalne monokultury 3D komórek chłoniaka, rakowych białych krwinek oraz kokultury chłoniaka i komórek podobnych do neutrofili w macierzy błony podstawnej.
Dodaj badany lek, który wiąże się z tubuliną wewnątrzkomórkową i zakłóca polimeryzację mikrotubul, powodując apoptozę komórkową.
W kohodowli bezpośredni kontakt komórek chłoniaka aktywuje komórki podobne do neutrofili, indukując wydzielanie cytokin.
Cytokiny te oddziałują z receptorami komórek chłoniaka, wyzwalając kaskady sygnalizacyjne i zwiększając ekspresję białek antyapoptotycznych, promując przeżycie komórek.
Wyrzuć nośnik. Dodaj bufor dysocjacyjny, aby zakłócić adhezję komórkową.
Zeskrob sferoidy i inkubuj je pod mieszaniem. Przenieść zawiesinę do probówek i kontynuować mieszanie w celu utworzenia zawiesiny jednokomórkowej.
Wprowadź koktajl przeciwciał sprzężonych z fluoroforem, który oznacza chłoniaka i komórki podobne do neutrofili.
Dodaj znakowaną fluoroforem anektynę V i jodek propidyny, aby oznaczyć apoptozę i martwe komórki.
Za pomocą cytometrii przepływowej wykryj zwiększoną przeżywalność komórek chłoniaka w kohodowli, co wskazuje na ochronę przed lekiem za pośrednictwem neutrofili.
Aby skonfigurować kohodowlę 3D, dodaj 50 000 samych komórek B chłoniaka RL lub wymieszaj z komórkami zróżnicowanymi HL60 w sterylnych 15-mililitrowych probówkach.
Odwiruj próbki i ponownie zawieś granulki w 300 mikrolitrach matrycy membrany podstawnej za pomocą 1-mililitrowej końcówki pipety z otworem przyciętym na 2 do 3 milimetrów. Następnie inkubuj 300 mikrolitrów komórek w każdym dołku 24-dołkowej płytki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.
Pod koniec inkubacji dodaj 1 mililitr kompletnej pożywki RPMI do każdej studzienki i wróć do kultur 3D do inkubatora na kolejne siedem dni ze zmianami pożywki co dwa dni. W dniu 5 dodaj do kultur 10 nanomolowych winkrystyny.
Po tygodniu hodowli odessać pożywkę i przemyć każdą studzienkę 2 razy 1 mililitrem lodowatego PBS. Następnie dodaj 3 mililitry lodowatego PBS z EDTA do każdej studzienki i zeskrob dno studzienek końcówką pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby odłączyć żele. Delikatnie potrząsaj talerzem na lodzie przez 30 minut. Następnie przenieś zawiesiny komórek do pojedynczych sterylnych 15-mililitrowych probówek w celu delikatnego potrząsania na lodzie przez kolejne 30 minut.
Potwierdź pojawienie się jednorodnej zawiesiny komórek. Następnie odwiruj komórki, a następnie przepłucz PBS i ponownie zawieś granulki w świeżym PBS za pomocą FBS. Na koniec oznacz komórki odpowiednimi przeciwciałami i barwnikami żywotności, jak właśnie pokazano, i przeanalizuj komórki zróżnicowane RL i HL60 za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zilustrowanej strategii bramkowania.