JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 2:46 min. • July 8th, 2025
Weź wielodołkową płytkę z przylegającą hodowlą mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC).
Dodaj komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub PBMC i inkubuj.
MSCs wydzielają czynnik wzrostu hepatocytów, indukując monocyty do uzyskania fenotypu immunomodulującego, wytwarzającego interleukinę-10 lub IL-10.
Przenieść supernatant zawierający PBMC do probówki.
Dodaj pokryte przeciwciałem kulki magnetyczne wiążące się z markerem powierzchniowym monocytów CD14.
Użyj separatora magnetycznego, aby wyizolować monocyty CD14 + i dodać je do studzienek wielodołkowych w rosnących stężeniach.
Wprowadź fluorescencyjne limfocyty T CD4 + efektorowe CD4 + znakowane barwnikiem fluorescencyjnym.
Dodaj mikrogranulki sprzężone z przeciwciałami, wiążące się specyficznie z markerami powierzchniowymi limfocytów T CD3 i CD28, aktywując komórki.
W grupie kontrolnej, w której brakuje monocytów, aktywowane limfocyty T proliferują, a każdy podział komórki zmniejsza intensywność fluorescencji CFSE w komórkach potomnych.
Jednak w kokulturach monocyty indukowane przez MSC wydzielają IL-10, hamując proliferację efektorowych limfocytów T.
Za pomocą cytometrii przepływowej obserwuj mniej limfocytów T wykazujących zmniejszoną intensywność fluorescencji CFSE wraz ze wzrostem stężeń monocytów, co wskazuje na zahamowanie proliferacji efektorowych limfocytów T przez monocyty indukowane przez MSC.
Aby wykonać test supresji efektorowej, należy rozpocząć od skonfigurowania kokultury MSC-PBMC z 2,5 x 106 PBMC, współhodowlanej z 250 000 MSC, aby zapewnić wystarczającą ilość współhodowlanych PBMC MSC do selekcji subpopulacji.
Po 48 do 72 godzinach w temperaturze 37 stopni Celsjusza należy wybrać interesujące nas leukocyty immunomodulujące indukowane przez MSC za pomocą odpowiednich kulek magnetycznych. Następnie dodaj znakowane CFSE allogeniczne limfocyty T CD4-dodatnie w 1 mililitrze kompletnej pożywki leukocytowej na studzienkę, w różnych proporcjach eksperymentalnych.
Następnie dodaj mikrogranulki sprzężone z anty-CD3 / 28 w stosunku 1 do 1 kulki do komórki, aby stymulować limfocyty T CD4-dodatnie. W trzecim dniu kohodowli oceń proliferację limfocytów T CD4-dodatnich znakowanych CFSE za pomocą cytometrii przepływowej.