Badanie przepływu in vitro wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów

Weźmy wstępnie zmontowane komory przepływowe połączone z systemami przepływowymi z filtrami transwell: jedna z monokulturą śródbłonka na górze, a druga z kulturą śródbłonka na górze i komórkami zrębu na dole.

Obie komory są wstępnie potraktowane cytokiną prozapalną.

W monokulturze cytokiny aktywują komórki śródbłonka, zwiększając ekspresję cząsteczek adhezyjnych.

Jednak wzajemne oddziaływanie między komórkami zrębu i śródbłonka w kohodowli prowadzi do wytwarzania przez komórki zrębu mediatorów regulacyjnych, które obniżają odpowiedź komórek śródbłonka na cytokiny prozapalne.

Umieść komorę na stoliku mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym.

Wprowadzić zawiesinę neutrofili

.

Neutrofile są rekrutowane i wiążą się z cząsteczkami adhezyjnymi śródbłonka poprzez przejściowe interakcje adhezyjne, ułatwiając ich interakcję z chemokinami związanymi z powierzchnią i tocząc się wzdłuż śródbłonka.

Ta interakcja aktywuje integryny na neutrofilach, stabilizując adhezję i powodując transmigrację przez komórki śródbłonka.

Jednak w kokulturze obniżona odpowiedź śródbłonka powoduje zahamowaną rekrutację neutrofili

.

Wizualizuj kultury pod mikroskopią z kontrastem fazowym, aby ocenić rekrutację neutrofili z przepływu.

W przypadku modelu filtra najpierw przytnij kawałek Parafilmu do tego samego rozmiaru co szklane szkiełko nakrywkowe, używając metalowego szablonu. Następnie wytnij szczelinę o wymiarach 20 na 4 milimetry w Parafilmie za pomocą metalowego szablonu, aby utworzyć kanał przepływu. Użyj uszczelki Parafilm, aby zaznaczyć kanał przepływu na szklanym szkiełku nakrywkowym. Dopasuj krawędzie sześciodołkowego filtra do szklanego szkiełka nakrywkowego. Upewnij się, że filtr zakrywa oznaczenia kanału przepływowego. Ostrożnie wytnij filtr za pomocą skalpela typu 10A.

Następnie ostrożnie przykryj filtr uszczelką Parafilm, upewniając się, że szczelina kanału przepływu znajduje się pośrodku filtra. Użyj kawałka czystej chusteczki i wypchnij wszelkie bąbelki. Teraz umieść szkiełko nakrywkowe we wgłębieniu dolnej płyty komory przepływowej z pleksiglasu.

Umieść górną płytę z pleksiglasu na górnej części uszczelki i skręć płytki ze sobą. Przekręć kran trójdrożny, aby bufor płuczący PBS-A mógł przepływać przez zawór. Następnie podłącz rurkę manometru do portu wlotowego górnej płyty pleksiglasowej. Przeprowadź PBS-A przez kanał przepływowy, aby umożliwić przejście pęcherzyków.

Następnie podłącz rurkę manometru z pompy strzykawkowej do portu wylotowego płytki pleksiglasowej. Wyczyść PBS-A, który kapał na górną płytę komory. Na koniec umieść komorę na stoliku mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym i dostosuj ostrość, aby uwidocznić komórki śródbłonka nad filtrami.

Aby wykonać perfuzję leukocytów nad komórkami śródbłonka, ustaw pompę strzykawkową na ponowne napełnienie i naciśnij Uruchom. Po dostosowaniu ostrości do wizualizacji monowarstwy komórek śródbłonka, umieść dwa mililitry oczyszczonych neutrofili w zbiorniku próbki i pozostaw do ogrzania na dwie minuty. Następnie myj śródbłonek PBS-A przez dwie minuty. Przekręć zawór, aby perfuzja neutrofili nad śródbłonkiem. Dostarczać bolus granulofilów obojętnochłonnych przez cztery minuty. Wyłącz zawór i wylej PBS-A ze zbiornika do płukania przez pozostałą część eksperymentu.

Podczas wykonywania eksperymentu należy upewnić się, że pęcherzyki powietrza nie przechodzą w żadnym momencie testu, ponieważ spowoduje to zakłócenie monowarstwy komórek śródbłonka i spowoduje oderwanie przylegających neutrofili.

Rejestruj rekrutację neutrofili podczas przepływu neutrofili lub po perfuzji za pomocą oprogramowania do przechwytywania obrazów cyfrowych. Zidentyfikuj środek kanału, przesuwając cel na krawędź kanału w porcie wlotowym i identyfikując środek portu. Wykonaj wszystkie nagrania cyfrowe z co najmniej 5 do 10 pól w środku kanału przepływowego.

Podczas nagrywania podczas przepływu neutrofili rób zdjęcia pojedynczego pola co 10 sekund przez jedną minutę. Poruszaj się wzdłuż kanału i rejestruj kolejne pole przez jedną minutę, powtarzając ten proces przez czas trwania bolusa.

Aby zarejestrować postperfuzję, wykonaj 10-sekundowe nagranie od 5 do 10 pól w dół środka kanału przepływu w celu oceny zachowania leukocytów. Rób zdjęcia co sekundę w 10-sekundowym interwale. Daje to wystarczająco dużo czasu na wychwycenie z przepływu i analizę zachowania przylegających neutrofili.

Rejestruj pojedyncze pole zawierające co najmniej 10 transmigrujących neutrofili przez pięć minut, wykonując zdjęcia co 30 sekund. Można to wykorzystać do obliczenia prędkości migrowanych komórek. Nagraj kolejną serię 10-sekundowych pól. Dzięki temu neutrofile mają czas na migrację przez monowarstwę śródbłonka.

Na koniec zatrzymaj pompę strzykawkową i wyjmij rurkę wylotową, a następnie rurkę wlotową. Zdemontować komorę przepływową i przepłukać zbiornik próbki za pomocą PBS-A. Powtórz dla kolejnych filtrów i kanałów mikroszkiełkowych przed przystąpieniem do analizy rekrutacji i zachowania leukocytów, jak opisano w protokole tekstowym.