$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Weźmy komórki rakowe wstępnie leczone lekiem chemioterapeutycznym, który indukuje starzenie się w pewnym odsetku komórek.
Komórki te gromadzą granulki autofluorescencyjnej lipofuscyny, znanego markera starzenia.
Dodaj antybiotyk, który dostaje się do komórek i hamuje lizosomalne pompy protonowe, zapobiegając zakwaszeniu lizosomalnemu.
Wzrost pH dezaktywuje enzymy lizosomalne.
Starzejące się komórki wykazują nadmierną ekspresję lizosomalnej β-galaktozydazy nawet przy pH zbliżonym do neutralnego, co czyni ją biomarkerem starzenia.
Wprowadzić substrat β-galaktozydazy. Inkubować.
β-galaktozydaza hydrolizuje zinternalizowany substrat do produktu fluorescencyjnego, znakując starzejące się komórki.
Odwirować i wyrzucić supernatant.
Dodaj barwnik żywotności komórek. W żywych komórkach aktywne esterazy przekształcają barwnik w nieprzepuszczalny dla błony produkt fluorescencyjny. Martwe komórki z naruszoną integralnością błony pozostają niezabarwione.
Za pomocą cytometrii przepływowej wykryj żywe komórki wykazujące podwójne markery lipofuscyny i fluorescencyjnego substratu β-galaktozydazy, wskazujące na komórki starcze.
Określ ilościowo procent komórek starczych, aby wykazać skuteczność leku.
Najpierw dostosuj lizosomalne pH hodowanych próbek komórek, dodając roztwór jednej mikromolowej bafilomycyny A w DMEM do osadu komórkowego w stężeniu jeden razy 10 do szóstych komórek na mililitr i odpipetuj do mieszania. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza na rotatorze z małą prędkością. Następnie, aby zabarwić beta-galaktozydazę związaną ze starzeniem się, dodaj do próbek roztwór podstawowy DDAOG w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr bez mycia.
Umieść na rotatorze na 60 minut, chroniąc przed bezpośrednim światłem. Tak jak poprzednio, odwirować probówki. Usunąć supernatant i umyć osad jednym mililitrem lodowatego 0,5% BSA w PBS. Następnie dodaj 300 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu fioletu kalcynowanego 450 AM do przemytych granulek komórek. Inkubować przez 15 minut na lodzie w ciemności.
Przenieś próbki komórek do probówek kompatybilnych z przyrządem do cytometrii przepływowej. W oprogramowaniu do akwizycji danych otwórz histogram kanału fioletowego i wykres kropkowy kanału dalekiego czerwonego w porównaniu z zielonym kanałem. Rozpocząć akwizycję danych cytometrycznych przy niskiej prędkości wlotu i umieścić dodatnie próbki kontrolne barwione DDAOG w porcie wlotowym. Rozpocznij pobieranie przykładowych danych. Dostosuj napięcia kanałów tak, aby ponad 90% zdarzeń było zawartych na każdym wykresie.
Gdy wszystkie ustawienia są optymalne, zarejestruj 10 000 zdarzeń na próbkę. Umieścić próbki kontrolne przeznaczone wyłącznie dla pojazdu zabarwione DDAOG w porcie wlotowym. Zainicjuj akwizycję danych i zarejestruj 10 000 zdarzeń na próbkę. Zwróć uwagę na wzrost sygnału autofluorescencji lub galaktozydu AF i DDAO w porównaniu z kontrolą pozytywną. Zapisz przykładowe dane w programie . FCS i eksportuj pliki do komputera stacji roboczej wyposażonej w oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej.