Kwantyfikacja starzejących się komórek nowotworowych wywołanych terapią za pomocą cytometrii przepływowej
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 4:19 min. • July 8th, 2025
Weźmy komórki rakowe wstępnie leczone lekiem chemioterapeutycznym, który indukuje starzenie się w pewnym odsetku komórek.
Komórki te gromadzą granulki autofluorescencyjnej lipofuscyny, znanego markera starzenia.
Dodaj antybiotyk, który dostaje się do komórek i hamuje lizosomalne pompy protonowe, zapobiegając zakwaszeniu lizosomalnemu.
Wzrost pH dezaktywuje enzymy lizosomalne.
Starzejące się komórki wykazują nadmierną ekspresję lizosomalnej β-galaktozydazy nawet przy pH zbliżonym do neutralnego, co czyni ją biomarkerem starzenia.
Wprowadzić substrat β-galaktozydazy. Inkubować.
β-galaktozydaza hydrolizuje zinternalizowany substrat do produktu fluorescencyjnego, znakując starzejące się komórki.
Odwirować i wyrzucić supernatant.
Dodaj barwnik żywotności komórek. W żywych komórkach aktywne esterazy przekształcają barwnik w nieprzepuszczalny dla błony produkt fluorescencyjny. Martwe komórki z naruszoną integralnością błony pozostają niezabarwione.
Za pomocą cytometrii przepływowej wykryj żywe komórki wykazujące podwójne markery lipofuscyny i fluorescencyjnego substratu β-galaktozydazy, wskazujące na komórki starcze.
Określ ilościowo procent komórek starczych, aby wykazać skuteczność leku
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych