Kwantyfikacja starzejących się komórek nowotworowych wywołanych terapią za pomocą cytometrii przepływowej

0 wyświetleń4:19 min • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weźmy komórki rakowe wstępnie leczone lekiem chemioterapeutycznym, który indukuje starzenie się w pewnym odsetku komórek.

Komórki te gromadzą granulki autofluorescencyjnej lipofuscyny, znanego markera starzenia.

Dodaj antybiotyk, który dostaje się do komórek i hamuje lizosomalne pompy protonowe, zapobiegając zakwaszeniu lizosomalnemu.

Wzrost pH dezaktywuje enzymy lizosomalne.

Starzejące się komórki wykazują nadmierną ekspresję lizosomalnej β-galaktozydazy nawet przy pH zbliżonym do neutralnego, co czyni ją biomarkerem starzenia.

Wprowadzić substrat β-galaktozydazy. Inkubować.

β-galaktozydaza hydrolizuje zinternalizowany substrat do produktu fluorescencyjnego, znakując starzejące się komórki.

Odwirować i wyrzucić supernatant.

Dodaj barwnik żywotności komórek. W żywych komórkach aktywne esterazy przekształcają barwnik w nieprzepuszczalny dla błony produkt fluorescencyjny. Martwe komórki z naruszoną integralnością błony pozostają niezabarwione.

Za pomocą cytometrii przepływowej wykryj żywe komórki wykazujące podwójne markery lipofuscyny i fluorescencyjnego substratu β-galaktozydazy, wskazujące na komórki starcze.

Określ ilościowo procent komórek starczych, aby wykazać skuteczność leku.

Najpierw dostosuj lizosomalne pH hodowanych próbek komórek, dodając roztwór jednej mikromolowej bafilomycyny A w DMEM do osadu komórkowego w stężeniu jeden razy 10 do szóstych komórek na mililitr i odpipetuj do mieszania. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza na rotatorze z małą prędkością. Następnie, aby zabarwić beta-galaktozydazę związaną ze starzeniem się, dodaj do próbek roztwór podstawowy DDAOG w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr bez mycia.

Umieść na rotatorze na 60 minut, chroniąc przed bezpośrednim światłem. Tak jak poprzednio, odwirować probówki. Usunąć supernatant i umyć osad jednym mililitrem lodowatego 0,5% BSA w PBS. Następnie dodaj 300 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu fioletu kalcynowanego 450 AM do przemytych granulek komórek. Inkubować przez 15 minut na lodzie w ciemności.

Przenieś próbki komórek do probówek kompatybilnych z przyrządem do cytometrii przepływowej. W oprogramowaniu do akwizycji danych otwórz histogram kanału fioletowego i wykres kropkowy kanału dalekiego czerwonego w porównaniu z zielonym kanałem. Rozpocząć akwizycję danych cytometrycznych przy niskiej prędkości wlotu i umieścić dodatnie próbki kontrolne barwione DDAOG w porcie wlotowym. Rozpocznij pobieranie przykładowych danych. Dostosuj napięcia kanałów tak, aby ponad 90% zdarzeń było zawartych na każdym wykresie.

Gdy wszystkie ustawienia są optymalne, zarejestruj 10 000 zdarzeń na próbkę. Umieścić próbki kontrolne przeznaczone wyłącznie dla pojazdu zabarwione DDAOG w porcie wlotowym. Zainicjuj akwizycję danych i zarejestruj 10 000 zdarzeń na próbkę. Zwróć uwagę na wzrost sygnału autofluorescencji lub galaktozydu AF i DDAO w porównaniu z kontrolą pozytywną. Zapisz przykładowe dane w programie . FCS i eksportuj pliki do komputera stacji roboczej wyposażonej w oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej.

06:47

Jednoetapowy protokół oceny sposobu klonogennej śmierci komórki wywołanej promieniowaniem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

08:52

Pomiar szybkości obrotu białek w starzejących się i niedzielących się hodowanych komórkach z etykietowaniem metabolicznym i spektrometrią mas

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

08:56

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

09:18

Właściwa metoda ilościowego oznaczania starzejących się komórek rakowych

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

13:59

Ilościowy pomiar reaktywnych form tlenu i fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się w normalnych ludzkich fibroblastach podczas starzenia się wywołanego onkogenem

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

07:39

Test przesiewowy oparty na SA-β-galaktozydazie do identyfikacji leków senoterapeutycznych

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

10:03

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

13:53

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów apoptotycznych w komórkach raka szyjki macicy SiHa leczonych aktynomycyną D

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

14:01

Sonda β-galaktozydazy związana ze starzeniem się w kolorze dalekiej czerwieni do identyfikacji i wzbogacania starzejących się komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

12:19

Systemy kohodowli in vitro w celu odtworzenia cyklu rak-odporność

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

Ostatnia aktualizacja: 1 sierpnia 2026