$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Weź płaską płytkę wielodołkową z dołkami zawierającymi bakterie w pożywce wzrostowej lub bakterie w pożywce wzrostowej uzupełnionej solą żółciową.
Sole żółciowe wywołują stres, powodując uszkodzenia komórek i uwalniając DNA i białka. Te biomolekuły pokrywają dno studzienek, umożliwiając ocalałym bakteriom przyleganie do powierzchni ciała stałego.
Przyłączone bakterie namnażają się, tworząc mikrokolonie i wytwarzając autoinduktory – czyli chemiczne cząsteczki sygnalizacyjne, umożliwiające komunikację bakterii.
Ta komunikacja skłania bakterie do kolonizacji i inicjowania produkcji zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych lub EPS, generując biofilm.
Po inkubacji usuń pożywkę, aby wyeliminować swobodnie pływające bakterie.
Wprowadź krystaliczną fioletową plamę, która oddziałuje z peptydoglikanem ściany komórkowej bakterii, nadając jej fioletowy kolor.
Usuń nadmiar plamy i wysusz. Nakładka z etanolem w celu rozpuszczenia fioletu krystalicznego ze ściany komórkowej bakterii, zmieniając kolor roztworu.
Intensywniejsze zabarwienie w studzienkach poddanych działaniu soli żółciowej niż w studzienkach niepoddanych działaniu soli żółciowej potwierdza tworzenie się biofilmu poprzez przyleganie do fazy stałej.
Najpierw oznacz dwie 1,5-mililitrowe rurki jako TSB i TSB plus BS. Następnie dodaj 1 mililitr TSB lub TSB plus BS do odpowiednich probówek.
Następnie zaszczepić probówki 20 mikrolitrami nocnej kultury w rozcieńczeniu 1:50. Następnie dodaj 130 mikrolitrów niezaszczepionej pożywki kontrolnej do każdej z trzech studzienek na sterylnej, przezroczystej, 96-dołkowej płytce z płaskim dnem poddanej działaniu kultur tkankowych. Będzie to pusta kontrolka.
Dodaj 130 mikrolitrów zaszczepionej kultury do każdej z trzech studzienek. Po dodaniu kultury kontrolnej i zaszczepionej do odpowiednich studzienek, inkubować 96-dołkową płytkę przez 4 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza statycznie. Po zakończeniu inkubacji ustawić kontrolkę jako pustą na czytniku płytek.
Następnie odessaj pożywkę hodowlaną z każdej studzienki. Następnie delikatnie umyj studzienki raz 200 mikrolitrami sterylnego PBS. Po umyciu odessać PBS, a następnie odwrócić płytkę do wyschnięcia przez około 20 minut.
Bardzo ważne jest, aby zapewnić delikatne usunięcie nośnika i delikatne mycie, aby upewnić się, że matryca EPS nie zostanie naruszona.
Następnie dodaj 150 mikrolitrów 0,5% fioletu krystalicznego do każdej z studzienek doświadczalnych i kontrolnych. Następnie inkubuj płytkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach umyj studzienki 400 mikrolitrami wody destylowanej. Dodaj 200 mikrolitrów wody destylowanej, aby pięciokrotnie umyć studzienki. Po wszystkich pięciu praniach odwróć talerz i pozostaw go do całkowitego wyschnięcia, chroniony przed światłem.
W celu uzyskania spójnych wyników ważne jest, aby próbki zostały dokładnie wysuszone przed kontynuowaniem.
Po całkowitym wyschnięciu płytki użyj 200 mikrolitrów 95% etanolu do odbarwienia studzienek. Następnie pozostaw płytkę na shakerze na 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby uniknąć parowania. Po 30 minutach zapisz OD540 na czytniku płytek.