Metoda przygotowania próbki w celu wizualizacji bakterii tworzących biofilm na strzępkach grzybów

Wprowadź kolonię grzybów związanych z celofanem do znakowanej fluorescencyjnie zawiesiny bakteryjnej. Usuń celofan i inkubuj.

Komórki bakteryjne przylegają do powierzchni grzyba za pośrednictwem cząsteczek powierzchniowych i receptorów. Przylegające bakterie wydzielają zewnątrzkomórkowe substancje polimerowe składające się z polisacharydów, białek i DNA, zatrzymując komórki bakteryjne i tworząc strukturalną podstawę biofilmu.

Opłucz sekcję w silnym roztworze soli, aby usunąć luźno związane bakterie

W buforze fosforanowym wytnij część kolonii.

Przenieś skrawek do sterylnej wody zawierającej aglutyninę z kiełków pszenicy lub WGA związaną z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym.

WGA, białko roślinne, wiąże się z N-acetyloglukozaminą i resztą kwasu sjalowego, umożliwiając przyłączony barwnik fluoryzację na ścianie komórkowej grzyba.

Przepłukać sekcję w buforze fosforanowym.

Częściowo zanurz suwak w buforze. Niech sekcja unosi się na nim. Delikatnie podnieś, aby sekcja osiadła bez przerywania biofilmu.

Umieścić podłoże montażowe, a następnie szkiełko nakrywkowe do analizy mikroskopowej.

Po wyhodowaniu bakterii przez noc odwiruj kulturę z prędkością 5,000 razy g przez trzy minuty, a następnie zawiesić osad w 25 mililitrach sterylnego 0,1-molowego buforu fosforanu potasu. Po powtórzeniu wirowania użyj tego samego buforu, aby dostosować końcowe stężenie bakterii do 10 do dziewiątych komórek na mililitr.

Napełnij 6-dołkową mikropłytkę 5 mililitrami zawiesiny bakteryjnej. Użyj sterylnej żyletki, aby pociąć błonę celofanową kultury grzybów na kwadraty, z pojedynczą kolonią na każdej membranie. Następnie za pomocą kleszczy ostrożnie usuń celofanowe kwadraty zawierające strzępki ze stałego podłoża i przenieś je do poszczególnych studzienek zawiesiny bakteryjnej.

Delikatnie potrząśnij mikropłytką, aż kolonie grzybów oderwą się od celofanu. Następnie usuń arkusze celofanu, pozostawiając kolonie grzybów na talerzu. Inkubować mikropłytkę z delikatnym mieszaniem w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez pewien czas, w zależności od użytych szczepów i etapu, który ma być analizowany.

W przypadku P. fluorescens BBc6/L. bicolor należy inkubować kultury przez 30 minut, aby uzyskać biofilmy we wczesnym stadium i do 16 godzin w przypadku dojrzałych biofilmów. Aby usunąć bakterie planktonowe i bakterie elektrostatycznie przyczepione do strzępek, opłucz grzyba, przenosząc go na nową 6-dołkową mikropłytkę wypełnioną mocnym roztworem soli. Delikatnie potrząsaj talerzem przez 1 minutę.

Przenieś grzyba na nową 6-dołkową mikropłytkę zawierającą 5 mililitrów sterylnego 0,1-molowego buforu fosforanu potasu. Delikatnie potrząsaj talerzem przez dwie minuty, a następnie przenieś grzyba do świeżego bufora.

Trzymając kolonię grzybów w buforze, użyj skalpela, aby przeciąć kolonię mniej więcej na pół. Przenieś połowę kolonii do barwienia na szalkę Petriego zawierającą 1 mililitr sterylnej wody uzupełnionej odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym w celu wizualizacji sieci grzybów, takiej jak aglutynina z kiełków pszenicy sprzężona z Alexa Fluor633. Następnie inkubować próbkę w ciemności.

Po barwieniu przepłukać próbkę, przenosząc ją na pokrywkę szalki Petriego zawierającą 10 mililitrów sterylnego 0,1-molowego buforu fosforanu potasu i delikatnie wstrząsać przez 1 minutę. Zanurz szkiełko do połowy w pokrywie szalki Petriego i delikatnie ustaw wyciętą sekcję tak, aby unosiła się nad szkiełkiem. Następnie powoli podnieś bok z roztworu buforowego, pozwalając próbce delikatnie osiąść na szkiełku.

Najdelikatniejszym aspektem jest ułożenie próbki na szkiełku. Aby uniknąć rozerwania biofilmu, próbka i szkiełko muszą być zanurzone podczas pozycjonowania próbki, a próbka nie może być już przenoszona przed obrazowaniem.

Na koniec dodaj 10 mikrolitrów przeciw blaknięciu podłoża montażowego do próbki i przykryj ją szklanym szkiełkiem nakrywkowym.