JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 4:23 min. • July 8th, 2025
Zacznij od wycinka guza płuc zawierającego rezydujące limfocyty T.
Limfocyty T migrują przez mikrośrodowisko guza i wchodzą w interakcje z komórkami nowotworowymi i elementami zrębu, pełniąc funkcje odpornościowe.
Skład mikrośrodowiska guza silnie wpływa na przemieszczanie się i prędkość limfocytów T.
Dodaj odrębne fluorescencyjnie sprzężone przeciwciała, aby znakować limfocyty T, komórki nowotworowe i elementy zrębu w mikrośrodowisku.
Dodaj DAPI, który nacieka komórki z uszkodzoną błoną plazmatyczną, aby zabarwić jądro, umożliwiając wizualizację martwiczych regionów w obrębie guza
.Obserwuj zabarwioną próbkę pod mikroskopem konfokalnym.
Używając odpowiedniego światła fluorescencyjnego, wybierz interesujący Cię obszar nowotworowy zawierający rezydentne limfocyty T. Oceń żywotność komórek, oceniając komórki DAPI-dodatnie.
Do analizy w czasie rzeczywistym zdefiniuj przedziały czasowe i całkowity czas nagrywania.
Aby przechwycić obrazy stosu z, zacznij od głębokości poniżej oznaczonych komórek T i przechwytuj obrazy w różnych odstępach czasu.
Wykorzystaj oprogramowanie śledzące, aby porównać długość przemieszczenia komórek T i średnią prędkość w różnych regionach guza.
Rozcieńczyć wymagane przeciwciała znakowane fluorescencyjnie i fluorescencyjny barwnik jądrowy, DAPI, do wymaganych stężeń końcowych w pożywce RPMI wolnej od czerwieni fenolowej. Następnie wyjmij płytkę hodowlaną z inkubatora i za pomocą cienkiej końcówki odessaj płyn z podkładek ze stali nierdzewnej.
Teraz, nie dotykając plasterka, dodaj 40 mikrolitrów rozcieńczonych przeciwciał na każdy plasterek guza. Aby umożliwić barwienie, inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po zakończeniu etapu barwienia, za pomocą drobnych kleszczy, usuń podkładki. Następnie delikatnie wyjmij plastry i zanurz je w podłożu RPMI1640 wolnym od czerwieni fenolu na 10 sekund. Umieść plastry z powrotem na wkładkach do hodowli komórkowych i dodaj kroplę pożywki RPMI1640 bez czerwieni fenolowej na każdy plasterek. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie przystąpić do obrazowania.
Na kilka godzin przed rozpoczęciem tego eksperymentu ustaw temperaturę komory grzewczej mikroskopu na 37 stopni Celsjusza, a następnie przygotuj mikroskop ustawiony do ciągłego perfuzji wycinków guza natlenionym pożywką RPMI bez czerwieni fenolowej i zasysania roztworu do kolby zbiorczej za pomocą pompy perystaltycznej.
Za pomocą cienkich kleszczyków wyjmij poplamiony plasterek z sześciodołkowej płytki i przenieś go do 35-milimetrowego plastikowego naczynia wypełnionego pożywką RPMI bez czerwieni fenolowej, a następnie umieść kotwicę plasterka na plasterku, aby go podeprzeć. Następnie umieść tę szalkę Petriego na stoliku do obrazowania mikroskopu.
Po połączeniu końcówek wlotowych i wylotowych systemu perfuzyjnego należy włączyć pompę perystaltyczną, aby umożliwić przejście natlenionego medium przez rurki perfuzyjne. Opuść obiektyw zanurzenia w wodzie do warstwy i skup się na górnej części warstwy przy świetle jasnego pola lub o odpowiedniej długości fali.
Następnie, używając odpowiednich filtrów, wizualizuj i wybierz interesujący obszar, który zawiera wszystkie fluorescencyjnie znakowane komórki zainteresowania, a mianowicie limfocyty T CD8, wyspy guzowe i komórki zrębu CD90-dodatnie. Skonfiguruj sesję obrazowania, używając odpowiedniej intensywności lasera i czasów naświetlania, aby dopasować się do jasności obserwowanych sygnałów fluorescencyjnych. Następnie ustaw grubość stosu Z, aby zobrazować w wycinku guza.
Następnie wybierz przedział czasu obrazu Z-stack i całkowity czas nagrywania, aby przechwytywać obrazy w określonych odstępach czasu. Po przechwyceniu i wyeksportowaniu obrazów fluorescencyjnych przeanalizuj migrację limfocytów T CD8 zgodnie z opisem w protokole tekstowym.