JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 4:11 min. • July 8th, 2025
Weźmy hodowlę komórek ssaków wykazującą ekspresję domeny powtórzeń białka tau wiążącego mikrotubule.
Te cytoplazmatyczne reportery tau posiadają mutację podatną na agregację i występują jako monomery.
Reportery są łączone z fluoroforem A lub B, przy czym widmo emisyjne pierwszego z nich pokrywa się z widmem absorpcyjnym drugiego.
Dodaj liposom skompleksowany z nasionami tau lub fibrylarnymi agregatami tau o pełnej długości.
Po wejściu do komórki liposom uwalnia nasiona w cytoplazmie.
Uwolnione nasiona pośredniczą w agregacji reporterów tau, zbliżając fluorofor A do fluoroforu B.
Dodaj trypsynę, aby oderwać komórki, a następnie wykonaj utrwalanie.
Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego.
Ze względu na bliskość w skupisku, po wzbudzeniu transfer energii z fluoroforu A do B poprzez oddziaływanie dipol-dipol jest określany jako transfer energii rezonansu fluorescencyjnego lub FRET.
Wzbudzony fluorofor B emituje sygnał FRET, którego obecność wskazuje na agregację białek.
Aby przeplate komórki biosensora w sterylnych warunkach, przepłucz każdą linię komórkową ciepłym PBS, a następnie wykonaj 3-minutową inkubację z trypsyną-EDTA. Gdy komórki się odłączą, przerwij reakcję z
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych