Technika cytometrii przepływowej FRET do wykrywania agregacji białek reporterowych indukowanej nasionami Tau

Weźmy hodowlę komórek ssaków wykazującą ekspresję domeny powtórzeń białka tau wiążącego mikrotubule.

Te cytoplazmatyczne reportery tau posiadają mutację podatną na agregację i występują jako monomery.

Reportery są łączone z fluoroforem A lub B, przy czym widmo emisyjne pierwszego z nich pokrywa się z widmem absorpcyjnym drugiego.

Dodaj liposom skompleksowany z nasionami tau lub fibrylarnymi agregatami tau o pełnej długości.

Po wejściu do komórki liposom uwalnia nasiona w cytoplazmie.

Uwolnione nasiona pośredniczą w agregacji reporterów tau, zbliżając fluorofor A do fluoroforu B.

Dodaj trypsynę, aby oderwać komórki, a następnie wykonaj utrwalanie.

Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego.

Ze względu na bliskość w skupisku, po wzbudzeniu transfer energii z fluoroforu A do B poprzez oddziaływanie dipol-dipol jest określany jako transfer energii rezonansu fluorescencyjnego lub FRET.

Wzbudzony fluorofor B emituje sygnał FRET, którego obecność wskazuje na agregację białek.

Aby przeplate komórki biosensora w sterylnych warunkach, przepłucz każdą linię komórkową ciepłym PBS, a następnie wykonaj 3-minutową inkubację z trypsyną-EDTA. Gdy komórki się odłączą, przerwij reakcję z ciepłą pożywką hodowlaną i natychmiast przenieś komórki do stożkowej probówki.

Odwirować komórki, ponownie zawieszając osad w świeżym podłożu. Następnie policz komórki i wykonaj rozcieńczenie komórek mastermix 3 500 000 komórek na 13 mililitrów pożywki. Za pomocą pipety wielokanałowej powoli przenieś 130 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z płaskim dnem poddanej kulturze tkankowej, uważając, aby umieścić końcówki pipet na środku dołków, nie dotykając dna płytki.

Po platerowaniu komórek pozwól im osiąść w spokoju przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i wilgotności względnej większej lub równej 80%. Następnego dnia, gdy komórki biosensora są w 60% do 65% zlewane, połącz zredukowaną pożywkę surowicy, odczynnik liposomowy i biologiczne źródło nasion, aby utworzyć kompleksy transdukcji.

Następnie delikatnie odpipetuj 20 mikrolitrów kompleksu transdukcji wzdłuż boku każdej pojedynczej studzienki biosensora i włóż leczone komórki do inkubatora na kolejne 24 do 48 godzin. Przed zbiorem nieleczone komórki będą wykazywać tylko rozproszoną fluorescencję. Jednak komórki potraktowane materiałem siewnym tau po 1 do 2 dniach pokażą jasne agregaty.

Aby zebrać komórki, zastąp pożywkę do hodowli komórkowej 50 mikrolitrami Trypsyny-EDTA, zatrzymując reakcję po 5 minutach 150 mikrolitrami schłodzonej pożywki hodowlanej. Natychmiast przenieś komórki na 96-dołkową płytkę z okrągłym dnem i zagnieść komórki. Odessać supernatant bez naruszania granulek, a następnie delikatnie, ale dokładnie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach 2% paraformaldehydu na 10 minut. Następnie ponownie odwiruj komórki i ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach schłodzonego buforu cytometrii przepływowej.