Technika oceny hamującego wpływu ekspozycji na toksyny na miniaturowe pobudzające prądy postsynaptyczne (mEPSC)

Traktuj kultury neuronalne rosnącym stężeniem testowej toksyny.

Toksyna dostaje się do komórek i jest uwalniana do cytozolu.

W zależności od swojego potencjału, toksyna może zapobiegać fuzji pęcherzykowej, hamując uwalnianie neuroprzekaźników.

Zastąp pożywkę buforem zawierającym określone związki neurofarmakologiczne w celu zablokowania neuronalnych potencjałów czynnościowych.

Umieść naczynie hodowlane na etapie elektrofizjologii. Aby rozpocząć nagrywanie, połącz somę neuronu z pipetą zawierającą elektrodę rejestrującą.

Zastosuj stałe podciśnienie, aby zassać niewielką część membrany, tworząc gigaseal, szczelne uszczelnienie, które zapewnia minimalne zakłócenia podczas nagrywania.

Utrzymuj stałe napięcie błony, aby mierzyć prądy neuronalne.

Zastosuj impulsy podciśnienia, aby rozerwać membranę, ustanawiając bezpośredni kontakt między neuronem a pipetą.

Rejestruj prądy wytwarzane w neuronach w wyniku wychwytu neuroprzekaźników, zwanych mEPSC.

Spadek częstości mEPSC przy zwiększonej ekspozycji na toksyny wskazuje na zahamowanie uwalniania neuroprzekaźników.

Rozcieńczyć neurotoksynę botulinową serotyp A do 100-krotności pożądanego stężenia końcowego w pożywce hodowlanej ESN i ogrzać do 37 stopni Celsjusza. Następnie należy dodać odpowiednią ilość toksyny do kultur DIV 21+ ESN. Zakręć naczyniem hodowlanym i wróć do inkubatora.

W pożądanym punkcie czasowym odessać pożywkę hodowlaną ESN i dwukrotnie przemyć zewnątrzkomórkowym buforem zapisowym lub ERB. Następnie dodaj 4 mililitry ERB uzupełnione 5 mikromolową tetrodotoksyną w celu zablokowania potencjałów czynnościowych i 10 mikromolową bicukuliną, aby zantagonizować aktywność receptora GABA_A. Następnie przenieś naczynie na stanowisko do elektrofizjologii. Ani perfuzja, ani kontrola temperatury nie są wymagane do mierzonego hamowania transmisji synaptycznej lub testu MIST.

Po użyciu ściągacza do mikropipet do wyciągania pipet borokrzemianowych o rezystancji od 5 do 10 megaomów, należy napełnić pipetę buforem do zapisu wewnątrzkomórkowego. Następnie delikatnie zanurz pipetę w odczynniku silikonowym. Przymocuj pipetę nagrywającą do uchwytu elektrody i podłącz strzykawkę wypełnioną powietrzem do rurki podłączonej do uchwytu elektrody. Zapewnić stałe nadciśnienie za pomocą strzykawki, jednocześnie opuszczając pipetę rejestrującą do ERB.

Po delikatnym wylądowaniu pipety rejestrującej na somie neuronu, który ma być rejestrowany, należy chwycić nadciśnienie, zrywając uszczelkę na strzykawce. Ponownie podłączyć strzykawkę i stosować stałe podciśnienie poprzez delikatne wdychanie, aby utworzyć uszczelnienie gigaomowe. Po uformowaniu uszczelki gigaomowej zmniejsz napięcie utrzymywania do minus 70 miliwoltów, a następnie ostrożnie zastosuj krótkie impulsy podciśnienia za pomocą strzykawki, aby przebić się do konfiguracji hurtowej.

Monitoruj skoki pojemności przez 30 sekund, aby potwierdzić, że poprawka jest stabilna. Anuluj skoki pojemności w oprogramowaniu hakerskim i przełącz się na bieżący tryb cęgowania, aby monitorować i rejestrować spoczynkowy potencjał membrany. Bez regulacji potencjałów złączy cieczy, spoczynkowy potencjał błony powinien wynosić od minus 67 do minus 82 miliwoltów.

Dostosuj wzmocnienie do 2 miliwoltów na pikoamper. Przełącz się w tryb cęgów napięcia i wykonuj ciągłe minus 70 miliwoltów, nagrywając przez 3 do 5 minut w celu wykrycia miniaturowych wzbudzających prądów postsynaptycznych.

Analizuj od 3 do 5 minut zarejestrowanych danych, aby wykryć MEPSC przy użyciu ustawień domyślnych dla EPSC receptora AMPA w minianalizie. Zbieraj i zapisuj informacje o wykrytych zdarzeniach. Po zebraniu częstotliwości mEPSC dla 8 do 12 próbek kontrolnych i od 8 do 12 próbek traktowanych neurotoksyną botulinową dla każdego warunku ekspozycji, przeanalizuj częstotliwość w stosunku do wieku i dopasowanych partii.