Produkcja i oczyszczanie rekombinowanych przeciwciał z komórek ssaków

Zacznij od probówki zawierającej oddzielne wektory dla genów przeciwciał o łańcuchach ciężkich i lekkich.

Dodaj odczynnik do transfekcji, aby utworzyć kompleksy z wektorami.

Przenieś tę mieszaninę do komórek gospodarza ssaków i inkubuj w celu internalizacji.

Dodaj środek przeciwzbrylający, aby promować równomierne rozmieszczenie transfekowanych komórek, poprawiając regenerację i wzrost komórek.

Dodaj roztwór antybakteryjno-przeciwgrzybiczy, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

W komórce gospodarza wektory integrują się z genomem gospodarza.

Po transkrypcji genów poszczególne mRNA opuszczają jądro i ulegają translacji, tworząc powstające łańcuchy przeciwciał.

Prawidłowe składanie i modyfikacja powstających łańcuchów daje ciężkie i lekkie łańcuchy.

Łańcuchy te łączą się, tworząc w pełni funkcjonalne przeciwciała, które są następnie uwalniane do pożywki zewnątrzkomórkowej.

Zbierz podłoże i odwiruj. Przefiltrować supernatant.

Przepuścić filtrat przez kolumnę oczyszczającą, która umożliwia selektywne wiązanie przeciwciał.

Za pomocą buforu elucyjnego elucję wymyć oczyszczone przeciwciała.

Hoduj komórki CHO w 200 mililitrach pożywki w długich kolbach Erlenmeyera z przegrodami. Połącz 5 mililitrów pożywki CHO freestyle z 50 mikrogramami zmiennego ciężkiego klonu DNA i 75 mikrogramami zmiennego lekkiego klonu DNA w 15-mililitrowej probówce. Następnie przekręć rurkę w wir. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 5 minut. Dodaj 750 mikrolitrów 1 miligrama na mililitr aminy polietylenowej do roztworu DNA i agresywnie wiruj go przez 30 sekund.

Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na dodatkowe 5 minut. Dodać całą mieszaninę do komórek CHO, ręcznie potrząsając kolbą. Natychmiast inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 130 obr./min.

Następnego dnia dodaj do komórek 2 mililitry 100x środka przeciwzbrylającego i 2 mililitry 100x przeciwbakteryjnego roztworu przeciwgrzybiczego do komórek. Inkubować kolby w temperaturze od 32 do 34 stopni Celsjusza, wytrząsając przy 130 obr./min. Kontynuuj hodowlę komórek przez 10 do 11 dni, dodając 10 mililitrów paszy tryptonowej N1 i 2 mililitry 100-krotnego suplementu glutaminy co piąty dzień. Policz komórki co trzeci dzień, aby upewnić się, że żywotność komórek utrzymuje się powyżej 80%. W dniu 10 lub 11 zbierz podłoże do oczyszczania przeciwciał, odwirowując kulturę w temperaturze 3000 g i 4 stopni Celsjusza przez 40 do 60 minut. Następnie przefiltruj przezroczyste media za pomocą filtra butelkowego o średnicy 0,22 mikrometra.

Aby oczyścić przeciwciała, należy zrównoważyć kolumnę białka A z dwiema objętościami buforu wiążącego w kolumnie. Przepuść przefiltrowane media przez kolumnę z natężeniem przepływu 1 mililitra na minutę. Następnie umyj kolumnę dwiema objętościami kolumn buforu wiążącego. Użyj 5 mililitrów buforu elucyjnego, aby wymyć przeciwciało do frakcji o pojemności 500 mikrolitrów.