Pomiar aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc przez przeciwciała HA

Weźmy na przykład seryjne rozcieńczenia przeciwciała skierowanego przeciwko hemaglutyniny wirusa grypy lub HA, glikoproteinie składającej się z globularnej głowy i łodygi.

Dodać rozcieńczenia do transfekowanych komórek ssaków wykazujących ekspresję związanego powierzchniowo kwasu hialuronowego. Przeciwciała wiążą się z regionami łodygi HA, tworząc kompleksy odpornościowe.

Wprowadź zmodyfikowane limfocyty T eksprymujące receptory Fc i kodujące reporter lucyferazy pod kontrolą czynnika transkrypcyjnego NFAT.

Podczas inkubacji przeciwciało związane z HA wiąże się z receptorem Fc, podczas gdy głowa HA wiąże się z kwasem sjalowym, wywołując aktywację limfocytów T i zwiększając stężenie wapnia cytozolowego.

Ta aktywacja inicjuje kaskadę sygnalizacyjną, która powoduje defosforylację NFAT, wywołując jego translokację jądrową.

NFAT wiąże się ze swoimi elementami odpowiedzi w genomie, napędzając ekspresję lucyferazy.

Dodaj przepuszczalne dla komórek podłoże bioluminescencyjne. Lucyferazy utlenia substrat, wytwarzając sygnał.

Zmniejszona luminescencja wraz ze spadkiem stężenia przeciwciał potwierdza aktywację limfocytów T za pośrednictwem przeciwciał T specyficznych dla łodygi HA.

Aby ocenić zdolność specyficznych przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania do celowania w komórki wykazujące ekspresję hemaglutyniny, zastąp supernatant kultur komórkowych zakażonych wirusem 25 mikrolitrami pożywki testowej cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał lub ADCC.

Następnie, na oddzielnej 96-dołkowej płytce, wykonaj 4-krotne rozcieńczenie interesujących przeciwciał w potrójnym i świeżym pożywce ADCC, zaczynając od 10 mikrogramów na mililitr zgodnie ze schematem, zwracając uwagę, aby uwzględnić tło i nie kontrolować przeciwciał.

Gdy całe przeciwciało zostanie rozcieńczone, przenieść 25 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała do odpowiednich studzienek na eksperymentalnej płytce komórkowej i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 15 minutach dodać 7,5 razy 10 do 4. zmodyfikowanych komórek efektorowych Jurkata, wyrażając odpowiedni receptor Fc na studzienkę w 25 mikrolitrach pożywki ADCC, aby uzyskać końcową objętość 75 mikrolitrów pożywki ADCC na studzienkę.

Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 6 godzin, rozmrażając bufor substratu lucyferazy w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza w ostatniej godzinie inkubacji. Gdy bufor jest gotowy, dodaj 75 mikrolitrów buforu substratu lucyferazy do wszystkich studzienek z wyjątkiem studzienki kontrolnej tła i odczytaj płytkę na luminometrze. Następnie można obliczyć krotną indukcję zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej w transfekowanych lub zakażonych kulturach komórkowych.