JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 3:32 min. • July 8th, 2025
Weź zawiesinę komórek NK lub NK.
Dodać przeciwciała monoklonalne anty-CD20 i inkubować.
W przypadku braku docelowych komórek nowotworowych wykazujących ekspresję antygenu CD20, region Fc przeciwciał wiąże się z receptorami FcγRIIIa na powierzchni komórek NK.
Po inkubacji dodać schłodzone podłoże. Odwirować i usunąć niezwiązane przeciwciała.
Następnie dodaj przeciwciała przeciwko ludzkiemu łańcuchowi lekkiemu κ. Inkubować.
Te przeciwciała drugorzędowe wiążą się z łańcuchem lekkim κ przeciwciał monoklonalnych.
Sieciowanie przeciwciał naśladuje wiązanie docelowego antygenu, wyzwalając wewnątrzkomórkową kaskadę sygnalizacyjną.
Powoduje to sztuczną stymulację komórek NK przy braku komórek nowotworowych.
Aktywowane komórki NK ulegają przegrupowaniu cytoszkieletu i uwalniają ziarnistości cytotoksyczne.
Ponadto komórki wytwarzają chemokiny i cytokiny.
Po upływie pożądanego czasu dodaj schłodzone podłoże, aby zatrzymać stymulację komórek.
Odwirować probówkę. Zebrać supernatant i osad komórkowy do dalszej analizy funkcji komórek NK efektorowych za pośrednictwem przeciwciał.
Dozuj 100 mikrolitrów zawieszonych komórek NK do 1,5-mililitrowych probówek lub 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery U i umieść komórki na lodzie. Przygotować rytuksymab lub inne badane przeciwciało w stężeniu 100 mikrogramów na mililitr.
Dodaj 1 mikrolitr do każdej probówki komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mikrograma na mililitr i inkubować komórki na lodzie przez 30 minut. Podczas inkubacji należy przygotować roztwór przeciwciała przeciwko ludzkiemu łańcuchowi lekkiemu kappa w pożywce o stężeniu 50 mikrogramów na mililitr. Potrzebna ilość roztworu przeciwciał wyniesie 50 mikrolitrów na próbkę komórki.
Podgrzej roztwór przeciwciała do 37 stopni Celsjusza na bloku grzewczym lub w łaźni wodnej. Po zakończeniu inkubacji komórek dodaj 1 mililitr lodowatej pożywki do każdej probówki i odwiruj komórki w temperaturze 135 razy g i 4 stopnie Celsjusza przez 5 minut. Ponownie umyj komórki 1 mililitrem lodowatego podłoża. Odessać supernatant po ostatnim przemyciu i dodać 50 mikrolitrów roztworu przeciwciała przeciwko ludzkiemu łańcuchowi lekkiemu kappa, aby aktywować komórki. Natychmiast umieść próbki komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza na bloku grzewczym lub w łaźni wodnej i inkubuj je do pożądanych punktów czasowych do analizy lub innych procedur.
Najlepszym sposobem radzenia sobie z wieloma próbkami jest użycie pływającego stojaka w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni, który można wyjąć i umieścić na lodzie, aby natychmiast zatrzymać wszystkie reakcje.