Technika wytwarzania przeciwciał monoklonalnych z limfocytów B specyficznych dla antygenu

Weźmy eukariotyczne wektory ekspresyjne, kodujące łańcuch ciężki przeciwciała lub łańcuch lekki przeciwciała, sklonowane z limfocytów B specyficznych dla antygenu.

Wprowadź polietylenininę, polimer kationowy, który elektrostatycznie oddziałuje z ujemnie naładowanymi wektorami, tworząc polipleksy.

Inkubuj komórki ssaków za pomocą polipleksów, które przylegają do komórek i są internalizowane przez endocytozę. Powstałe endosomy łączą się z lizosomami.

Polimery w polipleksach powodują osmotyczne pęcznienie pęcherzyka, co prowadzi do jego pęknięcia i uwolnienia wektorów.

Uwolnione wektory dostają się do jądra i są transkrybowane na mRNA o łańcuchach ciężkich i lekkich, które ulegają translacji przez rybosomy na retikulum endoplazmatycznym.

Powstałe łańcuchy peptydowe łączą się w przeciwciała, które są transportowane do Golgiego i pakowane w pęcherzyki wydzielnicze.

Po zespoleniu pęcherzyków wydzielniczych i błony komórkowej przeciwciała są uwalniane zewnątrzkomórkowo.

Pobrać supernatant zawierający przeciwciała do dalszych testów.

Wysiewaj 15 000 ludzkich embrionalnych komórek nerkowych w 200 mikrolitrach zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium, uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą w każdym dołku płaskiej 96-dołkowej płytki, dzień przed transfekcją. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc w temperaturze 5% dwutlenku węgla. Kotransfekcja komórek za pomocą liniowego odczynnika do transfekcji pochodnej polietylenu. Rozcieńczyć 0,5 mikrolitra odczynnika do transfekcji DNA 10 mikrolitrami 150 milimolowego chlorku sodu.

Następnie rozcieńczyć 0,125 mikrograma każdego zmiennego ciężkiego i lekkiego wektora wyrażającego łańcuch w 10 mikrolitrach 150 milimolowego chlorku sodu. Wirować wszystkie rozcieńczenia przez 10 sekund każde. Następnie wymieszaj wcześniej rozcieńczony odczynnik do transfekcji DNA z 10 mikrolitrami roztworu DNA. Szybko wirować mieszaninę transfekcji DNA przez 15 sekund i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Dodaj mieszaninę transfekcji DNA kroplami na komórki, a następnie delikatnie zakręć płytką. Wymień pożywkę 16 godzin po transfekcji i hoduj komórki przez pięć dni w pożywce bez surowicy w temperaturze 37 stopni Celsjusza.