Technika oczyszczania przeciwciał monoklonalnych wytwarzanych przez komórki jajnika chomika chińskiego

Weźmy kolumnę FPLC zawierającą porowatą szklaną żywicę z unieruchomionym białkiem A - białkiem bakteryjnym wiążącym przeciwciała. Zrównoważyć kolumnę buforem o neutralnym pH.

Dodać płyn do hodowli komórkowych pobrany z komórek jajnika chomika chińskiego, zawierający przeciwciała monoklonalne oraz zanieczyszczające białka i DNA.

Białko A wiąże się z regionem Fc przeciwciała, unieruchamiając je.

Niektóre zanieczyszczenia niespecyficznie przyczepiają się do żywicy, podczas gdy reszta przepływa.

Na chromatogramie zwiększona absorbancja promieniowania UV podczas ładowania próbki wskazuje na wysokie stężenie białka w przepływie.

Przemyć buforem równoważącym w celu usunięcia niezwiązanych zanieczyszczeń, co wskazuje na zmniejszenie absorbancji.

Przepłukać buforem o wysokiej zawartości soli, przerywając niespecyficzne interakcje i usuwając zanieczyszczenia, na co wskazuje niewielki pik zanieczyszczenia.

Dodaj bufor elucyjny o niskim pH, aby zakłócić interakcję białka A z przeciwciałem i wymyć przeciwciała, które są zbierane przez śledzenie odpowiedniego piku.

Zneutralizuj pH pobranych przeciwciał, aby zapobiec degradacji.

Zacznij od otwarcia oprogramowania dołączonego do systemu oczyszczania i umieszczenia 15-mililitrowych stożkowych probówek do zbierania oczyszczonego eluatu przeciwciał oraz 50-mililitrowych stożkowych probówek do zbierania przepływu podczas płukania o wysokiej zawartości soli do kolektora frakcji.

Następnie dodaj 0,22-mikrometrowy, przefiltrowany przez pory płyn z kultur komórkowych do pustej 12-mililitrowej strzykawki z zaślepioną dyszą. Po zdjęciu nakrętki włożyć dyszę strzykawki do portu do wstrzykiwania ręcznego systemu oczyszczania. Przekręcić strzykawkę, aby ją dokręcić, i wcisnąć tłok, aż cała objętość próbki zostanie wstrzyknięta i będzie widoczna w dołączonej 10-mililitrowej pętli próbki o dużej objętości.

Wybierz zapisaną metodę i kliknij przycisk Uruchom po wyświetleniu monitu przez oprogramowanie urządzenia. Gdy całe przeciwciało zostanie wymyte, natychmiast zneutralizować oczyszczone białko za pomocą 1 molowej zasady tris do pH około 5,5.