Test do wykrywania autoprzeciwciał w surowicy ludzkiej przy użyciu hodowli neuronów hipokampa

Weźmy hipokampy zarodków szczurów.

Dodaj trypsynę. Inkubuj, aby pośredniczyć w rozpadzie macierzy tkankowej, rozluźniając komórki hipokampa.

Rozcieńczyć buforem. Inkubować w celu kontynuacji trawienia enzymatycznego z trypsyną.

Następnie przenieś masę tkankową do probówki zawierającej podłoże. Kilkakrotnie pipetować w celu mechanicznej dysocjacji na pojedyncze komórki.

Komórki nasienne na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-L-lizyną na płytkach hodowlanych.

Inkubować. Komórki hipokampa przylegają do pokrytych powierzchni. Neurony rozwijają blaszkę i wydłużają drobne neuryty.

Ponadto neuryty rosną z procesami aksonalnymi i dendrytycznymi, tworząc sieć neuronalną.

Dojrzałe neurony wyrażają synaptyczne receptory pobudzające, receptory N-metylo-D-asparaginianu lub NMDAR.

Po inkubacji przemyć szkiełka nakrywkowe pożywką.

Dodaj rozcieńczoną surowicę pacjenta z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu. Autoprzeciwciała wiążą się z neuronalnymi NMDAR.

Umyj buforem, a następnie utrwal komórki.

Dodaj przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem, które wiążą się z autoprzeciwciałami związanymi z NMDAR.

Umyć buforem. Umieścić szkiełko nakrywkowe na podłożu montażowym zawierającym DAPI, aby wybarwić jądra.

Mikroskopowo obserwuj sygnały fluorescencyjne na neuronach, wskazujące na obecność autoprzeciwciał w surowicy.

W celu enzymatycznej dysocjacji hipokampa przy 1 mililitrze 2,5% trypsyny w 50-mililitrowej probówce zawierającej hipokampy, po doprowadzeniu objętości w probówce do 5 mililitrów za pomocą HBSS, inkubować probówkę przez 15 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby jeszcze bardziej rozcieńczyć trypsynę, dodaj 10 mililitrów podgrzanego HBSS i umieść probówkę z powrotem w łaźni wodnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza na 5 minut.

Następnie użyj mikropipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby przenieść hipokampy wyglądające jako masa śluzowa do 50-mililitrowej probówki i inkubować tkankę z 6 mililitrami wstępnie podgrzanego HBSS przez 5 minut, jak pokazano. Aby mechanicznie zdysocjować tkankę, przenieś masę hipokampa do 2-mililitrowej rurki ze stożkowym dnem. Po dodaniu 1 mililitra wstępnie podgrzanej pożywki DMEM, homogenizuj granulkę za pomocą mikropipety o pojemności 1,000 mikrolitrów, delikatnie zasysając w górę iw dół.

Uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków, powtórz aspirację góra-dół 10 do 20 razy za pomocą wstępnie wyciągniętej szklanej pipety, której końcówka styka się ze stożkowym dnem probówki, aż mieszanina stanie się przezroczysta. Policz komórki przed równomiernym rozprowadzeniem ich na 3,5-centymetrowym naczyniu skrzyżowanymi ruchami potrząsania. Po zakończeniu umieść naczynie w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.

W przypadku fluorescencyjnego barwienia immunologicznego 14-dniowych komórek in vitro, dodaj próbkę zawierającą przeciwciała anty-NMDAR do szkiełek nakrywkowych i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po godzinie potraktuj próbkę 4% formaldehydem w PBS, jako roztworem utrwalającym, w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie przemyj próbkę trzykrotnie PBS przez 5 minut każda, a następnie dodaj drugorzędowe przeciwciało kozie anty-ludzkie Alexa Fluor 488 w rozcieńczeniu od 1 do 1,000 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie zamocować szkiełka nakrywkowe zawierające próbkę za pomocą medium do montażu w cieczy i odessać pozostałą ciecz.