Test do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących specyficznego dla syncytialnego wirusa oddechowego

Weź seryjnie rozcieńczoną, inaktywowaną termicznie surowicę ludzką zawierającą syncytialny wirus oddechowy lub przeciwciała neutralizujące specyficzne dla RSV.

Dodaj zawiesinę wirusa. Przeciwciała neutralizują wirusy w sposób zależny od rozcieńczenia.

Wprowadzić mieszaninę do monowarstw ludzkich komórek nabłonkowych i inkubować w celu adsorpcji wirusa.

Wyrzuć mieszaninę. Dodać pożywkę zawierającą karboksymetylocelulozę, tworząc półstałą powłokę. Inkubować.

RSV wykorzystuje maszynerię komórki gospodarza do syntezy wirusowego RNA i białek, które następnie łączą się i pączkują jako indywidualne wiriony.

Zainfekowane komórki w końcu umierają. Karboksymetyloceluloza ogranicza przemieszczanie się wirusa, powodując miejscową infekcję i śmierć komórek, tworząc blaszki.

Usuń nakładkę.

Utrwal komórki za pomocą buforu zawierającego aceton. Wprowadź bufor blokujący zawierający detergent, aby przeniknąć komórki i zapobiec niespecyficznym interakcjom przeciwciał.

Dodaj pierwszorzędowe przeciwciała skierowane przeciwko białkom wirusowym.

Nakładka z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem skierowanymi na przeciwciała pierwszorzędowe.

Zobrazuj studzienki, aby określić ilościowo blaszki fluorescencyjne.

Najwyższe rozcieńczenie surowicy neutralizujące pięćdziesiąt procent RSV reprezentuje miano neutralizacji.

Przed inokulacją komórek A549 wirusem RSV należy zbadać płytkę komórkową pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić, że monowarstwy komórek A549 są w 80% zlewne. Następnie delikatnie odwróć płytkę, aby wyrzucić nośnik, i delikatnie osusz płytkę na sterylnym, chłonnym ręczniku papierowym. Po każdym umyciu przefiltrowanym, sterylnym PBS.

Następnie dodać 100 mikrolitrów mieszaniny wirus-surowica na studzienkę do odpowiednich studzienek na płytce komórkowej A549 zgodnie z szablonem płytki dostarczonym w manuskrypcie i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez jedną godzinę. Pod koniec inkubacji za pomocą pipety usunąć 90 mikrolitrów na studzienkę i dodać 100 mikrolitrów pożywki zawierającej 1X M 199, 1,5% CMC i 2% FCS oraz mieszaninę penicyliny i streptomycyny. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez trzy dni.

Aby utrwalić i rozwinąć płytkę testową, najpierw delikatnie odwróć płytkę komórkową A549 zakażoną wirusem RSV, aby wyrzucić pożywkę zawierającą M 199, CMC, 2% FCS i mieszaninę penicyliny i streptomycyny. Następnie powoli dodaj 200 mikrolitrów buforu utrwalającego do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie wyrzuć bufor utrwalający i delikatnie osusz chłonny ręcznik papierowy.

Pozostaw talerz do wyschnięcia ekranem do dołu na 10 minut. Następnie, za pomocą przefiltrowanego buforu PBS zawierającego 0,05 polisorbatu-20, przygotować 5% roztwór blokujący mleko. Dodaj 200 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Pod koniec inkubacji delikatnie odwrócić płytkę, aby wyrzucić roztwór, i osuszyć chłonny ręcznik papierowy.

Aby wytworzyć przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczyć od 1 do 500 przeciwciał Goat X RSV w roztworze blokującym. Dodaj 50 mikrolitrów do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Umyj płytkę trzykrotnie przefiltrowanym polisorbatem PBS.

Następnie wytwórz przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczając od 1 do 5,000 immunoglobuliny anty-koziej G AlexaFluor Donkey w roztworze blokującym. Dodaj 50 mikrolitrów do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Umyj płytkę pięciokrotnie przefiltrowanym polisorbatem PBS.

Aby policzyć płytki za pomocą automatycznego czytnika plamek, najpierw użyj nieużywanej 96-dołkowej płytki hodowlanej do kalibracji instrumentu, wprowadzając ustawienia zliczania w kanale FITC. Następnie odczytaj płytkę komórkową, zawiń ją w folię i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie sprawdź obrazy studzienek pod kątem sztucznych blaszek lub przerwanych monowarstw komórek i wyklucz studzienki z przerwanymi monowarstwami komórek.