Test in vitro w celu oceny wpływu przeciwciał na biofilm Candida tropicalis

Weź mikropłytkę zawierającą grzyba Candida tropicalis.

Komórki wydzielają Sap2, enzym proteolityczny, który rozszczepia transbłonową glikoproteinę zwaną Msb2, usuwając jej domenę hamującą.

To powoduje, że grzyb przylega do dna i rozwija się w mikrokolonię drożdży i form nitkowatych. Komórki wydzielają rozpuszczalne składniki i biopolimery, inicjując tworzenie biofilmu.

Dodać próbkę surowicy zawierającą przeciwciała specyficzne dla Sap2 do wybranych studzienek i inkubować w ciemności.

Przeciwciała wiążą się z Sap2 i neutralizują jego aktywność, utrudniając żywotność komórek i dojrzewanie biofilmu.

W nieleczonych studzienkach biofilm dojrzewa do gęstej sieci komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej.

Odessać płyn, umyć biofilm i wysuszyć płytkę na powietrzu. Dodaj substrat chromogeniczny i inkubuj w ciemności.

Żywe komórki, wykorzystując oksydoreduktazy związane z błoną, redukują substrat do kolorowego produktu.

Przenieść barwny supernatant i odczytać absorbancję.

Niższa absorbancja w studzienkach poddanych działaniu surowicy wskazuje na hamowanie biofilmu za pośrednictwem przeciwciał.

Przygotować seryjne rozcieńczenia próbek surowicy inaktywowanej termicznie w sterylnym pożywce RPMI1640 MOPS. Dodać 100 mikrolitrów wybranego rozcieńczenia surowicy do każdego dołka 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.

W kolumnie 10 dodać tylko pożywkę RPMI1640-MOPS do kontroli pozytywnej opartej wyłącznie na grzybach. Dodać rozcieńczenie surowicy w stosunku 1 do 50 do wszystkich studzienek w kolumnie 11, aby służyły jako kontrola ujemna surowicy bez grzybów i surowicy. Po przykryciu płytki pokrywką i folią aluminiową inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia, po ostrożnym zassaniu serum za pomocą pipety wielokanałowej, delikatnie postukaj w odwróconą płytkę, aby usunąć resztki surowicy. Powtórz mycie PBS trzy razy i susz płytkę na powietrzu przez 30 minut w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby wysuszyć nadmiar PBS.

Następnie rozpuść 25 miligramów XTT w 50 mililitrach sterylizowanego przez filtr mleczanu Ringera. Podwielokrotność 10 mililitrów w oddzielnych tubach. Przykryj folią aluminiową i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie rozpuść 8,6 miligrama menadionu w 5 mililitrach acetonu, a po rozprowadzeniu 50 mikrolitrów w 100 oddzielnych mikroprobówkach przechowuj porcje w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Weź 10 mililitrów XTT i dodaj 1 mikrolitr menadionu, aby uzyskać 1-mikromolowy roztwór roboczy. Dodać 100 mikrolitrów roztworu menadionu XTT na dołek 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Następnie, po przykryciu płytki pokrywką i folią aluminiową, inkubuj płytkę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Na koniec przenieś 80 mikrolitrów kolorowego supernatantu z każdej studzienki do świeżej płytki 96-dołkowej i odczytaj płytkę przy 490 nanometrach.