Oparta na immunofluorescencji metoda wizualizacji komórek kępek w kriosekcjach jelita drogowego

0 views • 3:31 min • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zacznij od naczynia hodowlanego zawierającego utrwalone formaliną, wypełnione żelatyną kriosekcje jelita czczego myszy z komórkami kępkowymi z mikrokosmkami wierzchołkowymi i somą w kształcie szpuli.

Przemyć buforem zawierającym detergent, aby przepuszczalność błon komórkowych.

Dodaj alkaliczny roztwór do pobierania antygenu. Inkubować w celu zerwania wiązań krzyżowych białek wywołanych fiksacją, odsłaniając białka do barwienia.

Zastosuj roztwór blokujący, aby zapobiec wiązaniu się nieswoistych przeciwciał.

Nakładka z pierwszorzędowymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko białku wiążącemu aktynę, specyficznie fosforylowanemu w komórkach kępkowych.

Usuń niezwiązane przeciwciała. Wprowadź mieszaninę przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z fluoroforem, barwnika wiążącego DNA i koniugatu faroidyny z barwnikiem fluorescencyjnym.

Przeciwciała drugorzędowe wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi, sprzężone znaczniki barwnika falloidyny i fluorescencyjnego aktyny, a barwnik wiążący DNA oznacza jądra komórkowe.

Usuń niezwiązane składniki i dodaj bufor bez detergentów.

Przenieś sekcję na szkiełko powlekane klejem, montując je za pomocą nośnika.

Pod mikroskopem konfokalnym zielone komórki w kształcie szpuli ze zintensyfikowaną fluorescencją na końcu światła i rozszerzoną masą czerwonych korzonków wskazują na obecność komórek kępkowych.

Aby przygotować skrawki jelita czczego, zacznij od ustawienia zarówno temperatury komory kriostatu, jak i temperatury obiektu na minus 22 stopnie Celsjusza. Umieść zamrożony blok tkanki w krioformie w komorze kriostatu na co najmniej 15 minut. Po 15 minutach przetnij blok na pół żyletką, aby odsłonić poprzeczny przekrój jelita czczego. Zamontuj połowę bloku na adapterze do kriostatu. Pokrój jelito czcze wypełnione żelatyną na odcinki o grubości 30 mikronów. Użyj zamrożonych kleszczy, aby delikatnie przenieść skrawki do 35-milimetrowego naczynia hodowlanego zawierającego 3 mililitry PBS.

Po trzykrotnym umyciu skrawków przez 5 minut każda 3 mililitrami PBS-T, dodać 3 mililitry świeżo przygotowanego roztworu do pobierania antygenu do naczynia zawierającego swobodnie pływające sekcje. Następnie zamknij pokrywkę, uszczelnij szczelinę między naczyniem a pokrywką paskiem taśmy winylowej i inkubuj w temperaturze 50 stopni Celsjusza w inkubatorze hybrydyzacyjnym przez trzy godziny bez wstrząsania.

Po barwieniu immunologicznym przenieś naczynie z wybarwionymi skrawkami w PBS do mikroskopu stereoskopowego. Umieść 200 mikrolitrów PBS w kropli na środku szkiełka z białego szkła pokrytego AMS. Następnie za pomocą końcówki pipety P200 przenieś jeden fragment jelita czczego z naczynia do kropli.

Po wyregulowaniu wyrównania sekcji zassać wszystkie pozostałe PBS otaczające sekcję. Dodaj 20 mikrolitrów wodnego podłoża montażowego i umieść szkiełko nakrywkowe na podłożu. Natychmiast uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego środkami montażowymi na bazie ksylenu i pozostaw do wyschnięcia na dwie do trzech godzin przed rozpoczęciem mikroskopii konfokalnej.

09:16

Hodowla narządów i barwienie immunofluorescencyjne całego wierzchowca mysich przewodów Wolffa

Related Videos

0 Views

06:09

Stosowanie barwienia immunofluorescencyjnego en face do bezpośredniej obserwacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych

Related Videos

0 Views

10:25

Izolacja i ocena ilościowa komórek szczoteczki z tchawicy myszy

Related Videos

0 Views

20:47

Technika jednoczesnej wizualizacji specyficznych dla wirusa limfocytów T CD8+ i komórek zakażonych wirusem in situ

Related Videos

0 Views

09:45

Wizualizacja komórek śródmiąższowych sieci Cajal (ICC) u myszy

Related Videos

0 Views

06:15

Metoda lokalizacji immunofluorescencji in vivo do badania biodystrybucji przeciwciał

Related Videos

0 Views

05:01

Multipleksowane obrazowanie immunofluorescencyjne w celu analizy subpopulacji limfocytów T opornych na immunoterapię

Related Videos

0 Views

07:05

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Related Videos

0 Views

09:51

Znakowanie immunofluorescencyjne mikrotubul i białek centrosomalnych w tkance jelitowej ex vivo oraz organoidy jelitowe 3D in vitro

Related Videos

0 Views

06:26

Zastosowanie przeciwciał anty-fosfo-girdyny do wizualizacji komórek kępek jelitowych w swobodnie pływających kriosekcjach jejunum myszy

Related Videos

0 Views

Last updated: 18 July 2026