Technika immunofluorescencji z podwójnym znakowaniem do wizualizacji białek gospodarza i patogenu w zakażonej komórce

Zacznij od utrwalonych i przepuszczalnych komórek nabłonka zakażonych patogennym pasożytem.

Dodaj bufor blokujący, aby zapobiec wiązaniu się przeciwciał nieswoistych.

Nakładka z mysimi poliklonalnymi przeciwciałami pierwszorzędowymi, specyficznie oddziałującymi z białkami pasożyta.

Dodaj dalekoczerwone przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem, które oddziałują z pasożytniczymi przeciwciałami pierwszorzędowymi związanymi z białkami.

Umyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał. Blokuj z przeciwciałami anty-mysimi, które wiążą się z przeciwciałami pierwotnymi, minimalizując reaktywność krzyżową podczas znakowania białka gospodarza.

Dodaj mysie monoklonalne przeciwciała pierwszorzędowe skierowane przeciwko rybonukleoproteinom gospodarza w komórkach nabłonkowych.

Nałożyć mieszaninę zielonych przeciwciał drugorzędowych znakowanych fluoroforem i falloidyny sprzężonej z czerwonym fluoroforem, ułatwiając znakowanie odpowiednio przeciwciał pierwszorzędowych związanych z białkiem gospodarza i aktyny.

Umyć buforem. Zamontuj za pomocą pożywki zawierającej barwniki DNA, nadając niebieskie zabarwienie jądru gospodarza, jądru pasożyta i kinetoplastowi.

Analizować próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego. Technika podwójnego znakowania immunofluorescencji pokazuje zielone białka gospodarza i czerwone białka pasożytnicze, umożliwiając ich precyzyjną lokalizację subkomórkową.

Dodaj komórki LLC-MK2 do 24-dołkowych płytek zawierających zaokrąglone szkiełka nakrywkowe sterylizowane promieniami UV i pozwól im osiąść przez 16 godzin. Następnie, aby zainfekować komórki, dodaj supernatant zawierający T. cruzi do każdej studzienki i inkubuj przez sześć godzin. Następnie przemyj szkiełka nakrywkowe zawierające zakażone i niezakażone komórki 5 razy PBS.

Następnie utrwal komórki za pomocą 2% paraformaldehydu i PBS. Po 10 minutach umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą PBS, a następnie przepuszczaj szkiełka nakrywkowe niejonowym detergentem przez 10 minut.

Po trzech 5-minutowych płukaniach PBS inkubować szkiełka nakrywkowe w roztworze blokującym przez 30 minut, a następnie kolejną 30-minutową inkubację z mysim przeciwciałem monoklonalnym lub poliklonalnym. Po przemyciu inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut z przeciwciałem drugorzędowym w roztworze blokującym i falloidyną, aby wybarwić włókna aktyny w komórce gospodarza.

Następnie ponownie umyj szkiełka nakrywkowe PBS trzy razy przed nałożeniem niewielkiej ilości odczynnika montażowego zapobiegającego blaknięciu z medium DAPI na powierzchnię szkiełka. Za pomocą kleszczy delikatnie przechyl szkiełko nakrywkowe w podłożu, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków.

W przypadku podwójnego znakowania, po inkubacji szkiełek nakrywkowych i roztworu blokującego, jak wykazano wcześniej, inkubować je w mysim przeciwciałie poliklonalnym przez 30 minut. Następnie przemyj szkiełka nakrywkowe trzy razy przez 5 minut za pomocą PBS, a następnie inkubuj je z przeciwciałem drugorzędowym przez 30 minut.

Następnie, po trzech płukaniach PBS, wykonaj drugi etap blokowania za pomocą AffiniPure króliczej anty-mysiej IgG rozcieńczonej w roztworze blokującym. Po 30 minutach ponownie przemyj szkiełka nakrywkowe PBS, a następnie inkubuj je z mysim przeciwciałem monoklonalnym przez kolejne 30 minut.

Następnie, po trzech płukaniach PBS, inkubuj szkiełka nakrywkowe z kozim przeciwciałem anty-mysim IgG2b i falloidyną. Następnie, po trzech płukaniach PBS, nałóż odczynnik montażowy zapobiegający blaknięciu, jak pokazano wcześniej.