JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 2:29 min. • July 8th, 2025
Rozpocząć od kolby zawierającej stabilnie transfekowane komórki ssaków w pożywce bez surowicy, uzupełnionej niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym, aby zapobiec agregacji komórek.
Komórki te mają zmodyfikowany genom zawierający zintegrowane geny o ciężkich i lekkich łańcuchach do produkcji przeciwciał terapeutycznych.
Wprowadź trypton, bogate w składniki odżywcze źródło peptydów i aminokwasów niezbędnych do metabolizmu komórkowego.
Komórka wykorzystuje te aminokwasy i peptydy i namnaża się, co powoduje przerost, który sprzyja wyższej wydajności przeciwciał.
Ekspresja genów w komórkach napędza produkcję polipeptydów o ciężkich i lekkich łańcuchach.
W retikulum endoplazmatycznym łańcuchy te fałdują się i dimeryzują poprzez międzyłańcuchowe wiązania dwusiarczkowe, tworząc przeciwciała terapeutyczne.
W aparacie Golgiego przeciwciała ulegają modyfikacjom potranslacyjnym. Następnie są pakowane w pęcherzyki i uwalniane do pożywki.
Inkubuj komórki przez dłuższy czas, aby zwiększyć produkcję przeciwciał.
Gdy żywotność komórek zaczyna spadać, zbierz supernatant.
Przefiltrować supernatant zawierający przeciwciała terapeutyczne i przechowywać go w niższej temperaturze do późniejszego wykorzystania.
Komórki nasienne w proporcji 2 x 105 komórek na mililitr w 100 mililitrach pożywki bez surowicy w dwóch kolbach. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przy 120 obrotach na minutę przez 24 godziny. Do kultury wzbogaconej składnikami odżywczymi dodaj trypton do końcowego stężenia 0,5%. Następnie użyj pożywki bez surowicy, aby wyrównać objętość niesuplementowanej kultury. Inkubuj komórki przez dodatkowe siedem dni.
Od ósmego dnia hodowli należy codziennie liczyć komórki za pomocą hemocytometru w celu monitorowania żywotności komórek. Gdy żywotność komórek osiągnie mniej niż 80%, zbierz kulturę przez odwirowanie w ilości 3,000 g przez 15 minut. Następnie przesterylizuj supernatant przez filtr o średnicy 0,22 mikrometra. Supernatanty należy przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez krótki czas lub zamrażać w temperaturze stopni Celsjusza przez długi czas.