JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:03 min • July 8th, 2025
Weźmy kolumnę chromatograficzną o powinowactwie zawierającą kulki agarozy sprzężone z białkiem A, białkiem wiążącym przeciwciała.
Dodaj bufor wiążący o neutralnym pH, aby zrównoważyć kolumnę.
Załadować supernatant hodowli z hodowli komórkowej wytwarzającej przeciwciała, zawierającej przeciwciała monoklonalne i zanieczyszczających białka komórkowe.
Neutralne pH ułatwia wiązanie białka A z regionem Fc przeciwciał podczas przepływu zanieczyszczeń.
Zmierz absorbancję UV przepływu, aby utworzyć chromatogram. Wysoka absorbancja podczas ładowania próbki wskazuje na niezwiązane białka w przepływie.
Przemyć kolumnę buforem wiążącym w celu usunięcia niespecyficznie związanych zanieczyszczeń.
Dodaj bufor elucyjny o niskim pH, aby zakłócić interakcję białka A z przeciwciałem. Zebrać eluowane przeciwciała, monitorując pik absorpcji.
Zneutralizuj pH, aby zapobiec degradacji przeciwciał i przenieś do filtra odśrodkowego.
Odwirować w celu zagęszczenia przeciwciał i ponownego zawieszenia w buforze do dalszych testów.
Po przygotowaniu i zainicjowaniu systemu FPLC zgodnie z protokołem tekstowym, użyj edytora metod, aby skonfigurować kroki uruchamiania w następujący sposób. Zrównoważ system za pomocą pięciu woluminów kolumn lub CV bufora wiązania.
Załadować próbkę do kolumny i zebrać przez nią przepływ próbki, a następnie użyć pięciu CV buforu wiążącego do przemycia systemu. Użyj pięciu CV buforu elucyjnego, aby wymyć kolumnę przez frakcjonowanie izokratyczne. i zebrać oczyszczone próbki przeciwciał jako frakcje za pomocą kolektora frakcji.
Na koniec zrównoważyć system za pomocą pięciu CV bufora wiążącego i zebrać przepływ do pojemnika na odpady. Po zakończeniu konfiguracji metody określ objętość kondycjonowanego podłoża, które ma zostać zastosowane do kolumny, i zapisz metodę.
Następnie zanurzyć rurkę pompy próbki w naczyniu zawierającym kondycjonowane medium. Następnie przygotuj oddzielny pojemnik, aby zebrać przepływ próbki przez określony przewód wylotowy. Włożyć probówki zbiorcze do kolektora frakcji i dodać bufor neutralizacyjny do każdej probówki zbiorczej. W module sterowania systemem oprogramowania otwórz metodę, która ma być używana. Następnie kliknij przycisk Start, aby rozpocząć uruchamianie.
Po zakończeniu oczyszczania i uruchomieniu modułu oceniającego, sprawdzić wynikowy chromatogram. Połącz wszystkie frakcje zawierające białko w probówce, a następnie użyj PBS i odśrodkowego urządzenia filtrującego z odcięciem 30 kilodaltonów, aby zagęścić próbkę i przeprowadzić wymianę buforową. Na koniec użyj testu BCA, aby zmierzyć stężenie przeciwciał zgodnie z instrukcjami producenta.